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抗体的制备与纯化

第一节常规抗血清的制备方法一、动物的免疫二、抗血清的采集

免疫动物的选择01抗原接种02佐剂的应用03动物的免疫

免疫动物的选择种属与品系经济性“R”型与“H”型经验性适配

剂量：注射途径：间隔与免疫时间：接种次数：抗原接种

机体，以提高抗原的免疫原01性的物质。02种类：非免疫原性物质03免疫原性物质04佐剂的概念与种类概念：与抗原同时或先于抗原进入

延长抗原的作用时间01增强吞噬作用02刺激抗原提呈03促进细胞因子分泌04诱导淋巴细胞分裂、增殖05影响T细胞“极化”06佐剂的作用机理

抗血清的采集采集方法血清的分离与灭活

采集方法一次性采集多次性采集

A血清析出的温度血清的灭活B抗血清的分离与灭活

第二节单克隆抗体的制备方法单克隆抗体与杂交瘤技术单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的特性

01单克隆抗体02杂交瘤技术单克隆抗体与杂交瘤技术

表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗体单克隆抗体

单克隆抗体由一个识别单一抗原决定簇（表位）的B细胞克隆所产生的同源抗体。

杂交瘤技术通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。

01020304050607致敏淋巴细胞的准备骨髓瘤细胞的准备细胞融合选择性培养单克隆抗体的制取抗体分泌细胞的筛选克隆化过程单克隆抗体制备过程

抗体分泌细胞筛选抗原致敏淋巴细胞骨髓瘤细胞融合选择性培养克隆化单抗制取单抗纯化单抗鉴定

动物选择：品系、年龄、性别、健康状态01抗原接种：方式——体内、体外02剂量——0.5-100?g03次数——视抗原而定04间隔——视抗原而定05佐剂——视抗原而定06收集时间：末次接种后72h07致敏淋巴细胞的准备

01细胞株处于良好的生长状态02细胞株保持HGPRT缺陷状态骨髓瘤细胞的准备

01方式：物理、化学、生物02PEG融合要点：（见图）细胞融合

致敏淋巴细胞骨髓瘤细胞离心1000rpm10min50%PEG1ml培养液10ml离心1000rpm7min37。C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内

随机融合后的细胞类型HAT选择培养原理0102选择性培养

骨髓瘤+骨髓瘤—不能生长细胞组合HGPRT生长状态淋巴细胞+淋巴细胞+短期生长淋巴细胞+骨髓瘤+长期生长未融合骨髓瘤—不能生长未融合淋巴细胞+短期生长随机融合后的细胞类型

HAT选择培养原理核苷酸从头合成途径（denovosynthesis）核苷酸补救合成途径（salvagesynthesis）HAT核苷酸DNA氨基碟呤（A）次黄嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）

对筛选方法的要求：多——大量样品一次检测快——迅速取得检测结果准——检测结果可靠性高灵——检测方法灵敏度高常用筛选方法：ELISA、RIA、CDC、IFA等抗体分泌细胞的筛选

概念：建立单一细胞克隆方法：有限稀释法克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞克隆化过程

有限稀释法102/ml10/ml103/ml计数2/孔

制取方式：01体外——培养罐法02体内——腹腔接种03纯化：04盐析、层析、制备型HPLC05鉴定：06特征鉴定——Ig类型、亲和力、效价、特异性07决定簇鉴定——是否针对同一决定簇08单克隆抗体的制取

多抗与单抗制剂的比较多抗单抗单抗（血清）（腹水）（培养上清）特异性抗体含量（mg/ml）无关Ig含量（mg/ml）100.5-1—其他血清蛋白