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基于分子模拟探究聚乙二醇修饰对重组葡激酶空间位阻影响

一、引言

1.1研究背景

1.1.1重组葡激酶的特性与应用

在医疗领域，血栓性疾病严重威胁人类健康，如心肌梗死、脑栓塞等，溶栓治疗是应对这些疾病的关键手段。重组葡激酶作为一种强效且具有纤维蛋白特异性的新型纤溶酶原激活剂类溶栓药物，在溶栓治疗中发挥着重要作用。

葡激酶最早于20世纪40年代末被发现，是由某些金黄色葡萄球菌菌株产生的具有活化纤溶酶原溶解血栓作用的蛋白质。1983年，Sako等首先克隆了葡激酶基因，并于1985年在大肠杆菌中实现表达，此后，重组葡激酶的研究不断深入。我国中科院上海植物生理研究所于1990年初步克隆了葡激酶基因，随后多家实验室也成功克隆并在大肠杆菌中实现高效表达，部分报道显示其产量达国外的6倍，并成功制备出重组葡激酶晶体。

重组葡激酶通过独特的作用机制实现高效溶栓。它与纤溶酶原按1:1的分子比例形成复合物，促使纤溶酶原活性部位暴露，由单链转变为双链的纤溶酶，进而形成活性葡激酶-纤溶酶复合物，该复合物再激活其他纤溶酶原分子，使其转变为纤溶酶，最终催化纤维蛋白溶解，实现血栓的溶解。在含人血凝块的人工循环系统中，3小时内50%溶栓的重组葡激酶浓度仅为2μg/ml，而链激酶则需12μg/ml，按等克分子量计算，重组葡激酶的纤溶效力是链激酶的2倍多。在动物血栓模型的溶栓实验中，同样表明重组葡激酶比链激酶具有更强或相同的溶栓效力。

除了对普通血栓具有良好的溶栓效果，重组葡激酶在处理富含血小板的凝块时也表现出色。在富含血小板血栓的狒狒股动脉血栓模型中，相同剂量的重组葡激酶与链激酶，能使血流恢复的时间分别为24分钟±分钟和120分钟，且重组葡激酶的作用更持久。研究发现，血小板不规则表面可增强重组葡激酶对纤溶酶原的活化，从而引发更强的溶栓效应。此外，当重组葡激酶与抗凝剂共同使用时，其溶栓效力会显著增强。

目前，重组葡激酶已在临床治疗急性心肌梗死和栓塞性疾病中得到应用，为众多患者带来了希望。然而，如同许多蛋白质类药物一样，重组葡激酶在实际应用中也面临一些挑战，如免疫原性问题，这可能导致机体产生免疫反应，影响药物的疗效和安全性，限制了其更广泛的应用。

1.1.2聚乙二醇修饰技术的发展

聚乙二醇修饰技术的兴起为解决蛋白质类药物的诸多问题提供了新的途径。聚乙二醇（PEG）是一种由重复的氧乙烯基组成的高分子聚合物，具有良好的水溶性，能溶于二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、苯、乙腈和乙醇等有机溶剂。它有2个末端羟基，具备线性（相对分子质量为5000～30000）或支化（相对分子质量为40000～60000）的链状结构。为获得单一功能的聚乙二醇，常将其一个末端羟基活化为甲氧基，即单甲氧基聚乙二醇（mPEG），在多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰研究中，应用最多的是单甲氧基聚乙二醇的衍生物。

聚乙二醇修饰技术，即聚乙二醇化，是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白、多肽、小分子有机药物和脂质体上。该技术的发展可追溯到20世纪70年代，最初主要应用于酶的修饰，以提高酶的稳定性和活性。随着研究的深入，其在药物研发领域的应用逐渐广泛。早期的修饰技术局限于使用相对分子质量低的单甲氧基聚乙二醇（20000）。经过不断的探索和改进，如今的聚乙二醇修饰技术能够实现对不同类型药物分子的精准修饰，并且可根据药物的特性和需求选择合适的聚乙二醇衍生物，如具有不同分子量、链结构和活性基团的聚乙二醇，以达到最佳的修饰效果。

在蛋白质类药物修饰方面，聚乙二醇修饰展现出诸多优势。它可以有效降低蛋白质药物的免疫原性，减少机体的免疫反应。由于聚乙二醇的无免疫原性和高度亲水性，修饰后的蛋白质药物在体内被免疫系统识别的概率降低，从而提高了药物的安全性。聚乙二醇修饰能够延长药物在体内的作用时间。聚乙二醇分子的存在增加了药物分子的体积，减缓了药物的代谢和排泄速度，使得药物能够在体内持续发挥作用，减少给药次数，提高患者的顺应性。修饰后的蛋白质药物还可能在稳定性、溶解性等方面得到改善，进一步提升药物的性能和疗效。美国FDA已批准聚乙二醇修饰的腺苷脱氨酶（PEG-ADA）用于临床治疗由于该酶缺陷而造成的严重综合免疫缺陷症（SOLD），这标志着聚乙二醇修饰技术在医药研究中的重要地位得到了认可。此后，越来越多的聚乙二醇修饰药物进入临床试验和市场，如聚乙二醇修饰的干扰素、粒细胞集落刺激因子等，为多种疾病的治疗提供了更有效的手段。

1.1.3空间位阻对蛋白质功能的影响

空间位阻在蛋白质的结构维持、活性调节以及与其他分子相互作用等方面起着关键作用。蛋白质的三维结构决定了其功能，而空间位阻是维持蛋白质特定三维结构的重要因素之一。蛋白