生物降解试验中接种物活性定量测量方法实验报告.docxVIP

国家计量技术规范规程制修订

《生物降解试验中接种物活性定量测量方法》实验报告

上海市检测中心

2021年4月

实验报告

一、实验目的

验证《生物降解试验中接种物活性定量测量方法》的适用性和可行性。二、实验地点

验证实验分别在上海市检测中心、上海博垒生物科技有限公司、上海大学、复旦大学、中国计量科学研究院、上海市计量测试技术研究院、上海市食品药品检验所、上海市质量监督检验技术研究院等8家机构进行。

三、环境条件

实验过程中环境温度均在温度：（15~30）℃、相对湿度≤85%RH。四、实验仪器与实验设计

生物降解试验中实际使用的接种物的性质随时间和地点的变化比较大，难以保存和转移，因此选择了一种商业化的标准接种物，Polyseed作为验证试验的样本。Polyseed的微生物群落结构和数量相对稳定，是美国环境保护署

（U.SEnvironmentalProtectionAgency,EPA）标准中五日生化需氧量（BiochemicalOxygenDemand,BOD5）测定的推荐接种物之一。用于生物降解试验的微生物被固定化在载体上，以胶囊的形式保存（可室温避光保存2年）。使用时，将胶囊内容物倒入水或者培养基中活化即可。

验证实验选择Promega公司的BacTiter-GloTM微生物细胞活力检测试剂盒

（BacTiter-GloTMMicrobialCellViabilityAssay，SN.G8230）和碧云天（Beyotime）公司的ATP检测试剂盒（SN.S0026）检测样本的ATP含量，选择了Berthold公司的OrionII型和LB960型、Tecan公司的Spark型和InfiniteM200型、BioTek公司的SynergyH1型和Cytation3型、Delta公司的ToxII型、SpectraMax公司的M5型和Paradigm型等多种ATP荧光检测仪，累计收集了12次实验的数据。

五、校准设备和仪器

标准物质

5’-三磷酸腺苷（ATP）二钠盐纯度标准物质研制（生产）单位：中国计量科学研究院

标物编号：NIM-RM3690标准值：92.0%（g/100g）

扩展不确定度：0.7%（g/100g），k=2

测试样本

选择商业化接种物PolySeed?(#P-110)（以下简称“PolySeed”，Lot.102001）作为验证实验的样本。使用前，按照以下步骤制备PolySeed样本：

用分析纯试剂配制下列贮备液：

贮备液

成分

浓度（g/L）

贮备液(a)

KH2PO4

8.50

K2HPO4

21.75

Na2HPO4·2H2O

33.40

NH4Cl

0.5

贮备液(b)

CaCl2

27.50

或CaCl2·2H2O

36.40

贮备液(c)

MgSO4·7H2O

22.50

贮备液(d)

FeCl3·6H2O

0.25

制备矿质培养基1L：将10mL溶液（a）加800mL无菌水，再加溶液（b）、

（c）和（d）1mL，加无菌水定容到1L，用HCl或NaOH调pH到7.2-7.4。矿质培养基现配现用，不保存。如果贮备液出现沉淀，则需重新配制。

取100mL矿质培养基，放入250mL烧杯中，加入转子。

取5粒胶囊，将其内容物加入到100mL矿质培养基中，搅拌并曝气1h

即得到样本溶液。六、实验结果

上海市检测中心BertholdOrionII验证试验（一）校准单位：上海市检测中心

ATP检测试剂名称：BacTiter-GloTM微生物细胞活力检测试剂盒（BacTiter-GloTMMicrobialCellViabilityAssay）

ATP检测试剂生产厂商：PromegaATP检测试剂货号：G8230

ATP荧光检测仪名称：板式化学荧光检测仪

ATP荧光检测仪生产厂商：Berthold

ATP荧光检测仪规格型号：OrionII

环境温度：22.7℃相对湿度：77.2%RH

校准日期：2020年12月02日

样本溶液的仪器测定结果

编号

1

2

3

4

5

6

仪器荧光示值RLU

30107

29561

34829

32355

29469

31356

样本溶液的仪器示值RLU

（平均值）

31280

重复性RSD%

6.61

注：ATP标准曲线为y=3163.7x+18229，R2=0.9996（线性相关系数r=0.9998）

样本溶液的活细胞浓度

样本溶液的仪器示值

RLU（平均值）

由校准方程求得的样本溶液中ATP浓度的测定nmol/L