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带组氨酸标签的登革病毒2型和4型病毒样颗粒的表达、鉴定与纯化技术研究

一、引言

1.1研究背景与意义

登革热是一种由登革病毒（DENV）引发的急性病毒性传染病，主要通过伊蚊叮咬传播，在全球热带和亚热带地区广泛流行。世界卫生组织（WHO）数据显示，全球每年约有四亿人感染登革病毒，其中50万人发展为重症，死亡近两万人。仅2023-2024年，东南亚和南美地区就有大量登革热病例，如巴西在2024年3月前就有超150万疑似病例和500多例死亡病例，预计全年病例将超400万，创历史新高。我国广东、云南等地也是登革热的主要流行区，2014年广东疫情发病人数超五万，2023年全年报告近2万例。登革病毒严重威胁全球公共卫生安全，已被WHO列为“全球十大健康威胁”之一。

登革病毒属于黄病毒科正黄病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为11kb，包含一个开放读码框，编码3个结构蛋白（C、prM和E）和7个非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）。自然界中存在DENV1-DENV4四种血清型，各型之间缺乏交叉保护，多次感染或同时感染不同血清型的情况并不罕见。登革病毒感染后的临床表现复杂多样，多数为无症状感染，有症状的患者可分为登革热和重症登革。前者一般表现为高热、头痛、关节痛、皮疹等感冒样症状，具有自限性；后者则可发展为出血、肝损害、休克等严重症状，病情危重，若救治不及时，病死率可达30%。目前临床上对于登革热尚无特效药物治疗，主要采取对症治疗和支持疗法，因此开发有效的疫苗和深入了解病毒机制迫在眉睫。

疫苗接种是控制传染病最有效的手段之一，登革疫苗的研发已历经近百年，包括灭活疫苗、减毒疫苗、重组蛋白疫苗、减毒活疫苗等多种类型。目前，虽已有两款登革四价减毒活疫苗（Dengvaxia和Qdenga）在海外获批上市，还有一款（TV003）完成临床III期试验，但这些疫苗在使用范围和效果上存在一定局限性。比如Dengvaxia在特定人群中可能增加罹患登革热住院风险；Qdenga在登革血清阴性人群中对DENV3的保护效力不明显，还可能导致更高住院率；TV003对于2-6岁受试者的长期保护效果以及接种后是否会出现突破感染等仍需进一步评估。此外，我国尚未批准任何登革疫苗，多数品种处于临床前研究阶段。

病毒样颗粒（VLPs）是不含病毒核酸的空壳结构，由病毒结构蛋白自动组装而成，在形态结构上与天然病毒颗粒相似，具有很强的免疫原性和生物学活性，且不含有病毒遗传物质，不具有感染性。因此，VLPs在疫苗开发中极具潜力，已成为研究热点。多种病毒的结构蛋白都能在不同表达系统中组装成VLPs，如乙肝病毒、人乳头瘤病毒等的VLPs疫苗已成功应用于临床。在登革病毒研究领域，构建和研究登革病毒VLPs对于开发新型疫苗和深入了解病毒致病机制具有重要意义。

本研究聚焦于带组氨酸标签的登革病毒2型和4型病毒样颗粒，旨在通过构建带有组氨酸标签的DENV2和DENV4基因组，利用转染技术在细胞中表达VLPs，再使用Ni-NTA融合蛋白层析柱纯化样品，最后通过SDS-PAGE凝胶电泳和Westernblot检测等方法评估样品纯度和可靠性。成功表达和纯化带组氨酸标签的DENV2和DENV4病毒样颗粒，不仅能为登革病毒分子机制和病理学机制的深入研究奠定基础，还可用于药物筛选和疫苗开发等相关研究，为解决登革热这一全球性公共卫生问题提供新的思路和实验依据。

1.2国内外研究现状

登革病毒样颗粒（VLPs）作为疫苗研发的重要方向，在国内外均受到广泛关注。

在国外，对登革VLPs的研究起步较早，进展也较为显著。早期，研究主要集中在VLPs的构建和表达。例如，通过将登革病毒的结构蛋白基因（如C、prM和E基因）导入不同的表达系统来实现VLPs的表达。哺乳动物细胞表达系统因能对蛋白质进行正确的折叠和修饰，利于VLPs的组装，被广泛应用。有研究利用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞成功表达了登革病毒1型和2型的VLPs，通过电镜观察到所形成的VLPs在形态上与天然病毒颗粒相似。杆状病毒/昆虫细胞表达系统也展现出独特优势，如能实现大规模表达且成本相对较低。利用该系统表达登革病毒4型VLPs时，通过优化表达条件，可提高VLPs的产量和质量。

随着研究的深入，对登革VLPs的鉴定技术不断更新和完善。除了传统的电镜观察用于直观了解VLPs的形态结构外，还运用了多种先进技术。免疫印迹（Westernblot）技术可特异性地检测VLPs中的目标蛋白，