基因工程及其在医学中的应用课件.pptVIP

基因組DNA文庫cDNA文庫粘性末端連接（二）目的基因與載體的連接BamHⅠ切割反應GGATCCCCTAGGT4DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連2.平端連接適用於：限制性內切酶切割產生的平端粘端補齊或切平形成的平端導入種類載體宿主轉化質粒細菌轉染噬菌體或病毒真核細胞轉導噬菌體細菌轉化、轉染和轉導的區別（三）重組體導入受體細胞BamHⅠ切割反應GGATCCCCTAGGT4DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體目的基因自連載體自連（四）基因工程菌的篩選直接選擇法：抗藥性標記選擇藍白斑篩選法菌落或噬菌體的原位雜交非直接選擇法：免疫學方法(插入失活法)抗藥性標記選擇目錄重組DNA技術操作過程可形象歸納為小結分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉轉入受體菌篩篩選重組體重組DNA技術操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產物限制酶消化開環載體DNA目的基因連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交（五）外源基因的表達種類功能所含特異序列克隆載體外源基因擴增複製子多克隆位點篩選標誌表達載體外源基因表達複製子多克隆位點篩選標誌基因表達的調控序列克隆載體和表達載體的比較分子雜交以DNA的變性和複性為理論基礎。DNA變性：DNA在某些理化因素的作用下堿基對間氫鍵破壞，由雙鏈變成單鏈的過程。DNA的複性：變性DNA的單鏈重新合成雙鏈的過程。分子雜交：不同來源的單鏈核酸通過堿基互補形成雜合雙鏈的過程。分子雜交第二節常見分子生物學技術一、分子雜交（molecularhybridization）複性RNADNA（一）核酸探針（probe）1、定義：是分子雜交的技術基礎，它是一段與被檢測核酸序列互補的帶有標記的核苷酸片段，長度一般為十幾到幾千個堿基不等。2、探針標記方法：（1）放射性同位素標記（2）光敏生物素標記（3）地高辛標誌物（4）分子信標（二）分子雜交的方法斑點雜交(dotblothybridization)DNA點陣（DNAarray）基因晶片（genechips）原位雜交(insituhybridization)轉移印跡技術變性DNA或RNA探針雜交液NC矽片（三）印跡技術的類別及應用1、DNA印跡技術(Southernblotting)用於基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析。2、RNA印跡技術(Northernblotting)用於RNA的定性定量分析。3、蛋白質的印跡分析(Westernblotting)用於蛋白質定性定量及相互作用研究。分子雜交實驗①②③二、聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C95?C55?C72?CPCR的主要用途（一）目的基因的克隆（二）基因的體外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）測定基因的表達水準*************第一步，從一只6歲的芬蘭多塞特種母羊的乳腺中取出一個本身並沒有繁殖功能的普通細胞，將這個細胞的基因分離出來。第二步，對一頭蘇格蘭黑臉種母羊注射促性腺激素，經過28－33小時後取出卵，儘快去核，將這只卵細胞的基因取出，換上第一只羊的乳腺細胞的基因，再將這個基因已經調包的卵細胞放電啟動。這樣，這只已經調了包的卵細胞就像所有正常受精的卵細胞一樣進行著正常的細胞分裂。第三步，當調包的卵細胞分裂到一定階段，胚胎已經形成後，再將這個胚胎移植到第三只母綿羊的子宮裏。第三只母綿羊經過正常的妊娠後，多利就降生了。科學家們用DNA分析法表明：多利的細胞與供體細胞相似。從這一過程來看，多利有什麼特別