猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体：制备工艺优化与多元应用探索.docxVIP

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体：制备工艺优化与多元应用探索

一、引言

1.1研究背景

猪繁殖与呼吸综合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome，PRRS），俗称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道症状和高病死率为特征的传染病，是一种世界范围内广泛流行的猪传染性疾病。自1987年首次在美国发现以来，相继在各国呈流行性感染，给世界养猪业造成了严重的经济损失，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的动物疫病，中国将其列为二类动物疫病。2006年5月，由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株引起的猪“高热综合症”首先爆发于中国江西，随后迅速扩散到周边省份，至2007年，该病已遍布全国绝大多数省份，使中国养猪业遭受了巨大的损失。近年来，越南、老挝、缅甸等周边国家也相继暴发PRRS。

PRRSV属于尼多病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，是有囊膜的单股正链RNA病毒。病毒粒子呈卵圆形，直径50-65nm，核衣壳直径30-35nm，呈二十面体对称。其基因组约为15kb，包括位于5′端的帽子结构和非翻译区（UTR），以及位于3′端的UTR和poly（a）尾。在5′端和3′端之间，PRRSV编码至少10个开放阅读框（ORFs），分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-7和ORF5a。其中，ORF1a和ORF1b占病毒基因组的四分之三，主要通过核糖体移码编码复制酶多聚蛋白pp1a、pp1a-nsp2n、pp1a-nsp2tf和pp1ab，这些多聚蛋白被水解加工成至少16种功能性非结构蛋白（nsp），负责病毒基因组的复制和转录；ORF2-7编码病毒的结构蛋白，包括囊膜糖蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、非糖基化膜蛋白M以及核衣壳蛋白N。

PRRSV具有毒株多样性、易基因重组、抗体依赖增强作用（ADE）、中和抗体延迟效应、免疫抑制等复杂的特点，导致疾病防控难度较大。当前流行的主要是欧洲型（基因I型）和北美型（基因II型），在中国猪场中PRRSV以变异株为主，占90%以上，经典株约占10%，且经典毒株比例近些年有所上升，防控形势严峻。不同毒株间、疫苗毒株与野毒之间可发生基因重组，出现新的毒株。当猪只体内的抗体不能完全中和相应的病毒时，会增强病毒对巨噬细胞的侵袭能力，即抗体依赖增强作用（ADE），在感染猪蓝耳病毒后28日才产生消灭病毒的中和抗体，而且其维持时间较短，在这之前ADE作用可能导致猪群发病。动物针对PRRSV许多蛋白和结构蛋白的体液免疫出现在感染后1周内，2-4周左右IgM转变为IgG，IgG峰值出现在4-5周左右并维持时间长，但是针对GP5和M蛋白的IgG抗体出现时间和到达峰值的时间都较晚，中和抗体在免疫后4-5周后才能产生，而先于高水平中和抗体产生的亚中和滴度抗体因ADE作用，从而促进病毒进行大量复制，加重猪只的临床症状。猪出现病毒血症感染后，PRRSV长时间存在于扁桃体和淋巴结，尤其以腹股沟淋巴结和胸骨淋巴结积蓄严重而出现持续性感染，感染猪群排毒时间可达80-100d，最长达到200d以上，猪场因长时间病毒的存在而导致猪群水平传播严重，特别怀孕母猪、后备母猪的持续感染造成垂直传播损失更大。猪感染PRRSV后，PRRSV首先在局部的巨噬细胞中复制，然后迅速向淋巴结和肺扩散，有时也向其他组织扩散，对免疫系统的破坏造成了猪群的免疫抑制，造成猪只免疫能力低下，对肺部的侵害更加打通了呼吸道的门户，让更多能通过呼吸道感染的病毒、细菌及寄生虫到达肺部进而对全身感染，造成猪群的继发感染和混合感染，猪群发病率和病死率随之上升。

目前，对PRRS的防控主要依靠疫苗接种、生物安全措施以及加强饲养管理等综合手段。然而，由于PRRSV的高度变异性和复杂的免疫机制，现有疫苗仍无法诱导足够有效的中和抗体，减毒疫苗也引发了安全问题，如中国接种过相关疫苗的猪中爆发了NADC-30样菌株。因此，开发更加有效的诊断方法和防控措施对于控制PRRS的传播和降低其对养猪业的危害具有重要意义。单克隆抗体技术具有高度特异性和敏感性，在病毒检测、诊断和致病机制研究等方面具有广泛的应用前景。制备针对PRRSV的单克隆抗体，不仅可以用于建立快速、准确的诊断方法，还可以深入研究病毒的结构与功能、病毒与宿主的相互作