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基于侵染蛋白的重组杆状病毒高效生产技术与机制探究

一、引言

1.1研究背景与意义

自1983年Smith等利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）在草地贪夜蛾细胞（Sf9）中高水平表达β-干扰素，成功建立杆状病毒-昆虫表达系统以来，该系统已成为基因工程领域中极为重要的组成部分，在生命科学各个研究领域展现出强大的生命力。杆状病毒（Baculovirus）属于双链环状有囊膜的DNA病毒，基因组大小在90kb-180kb之间，自然界中主要感染节肢动物，尤其是鳞翅目昆虫。

杆状病毒表达载体系统在表达真核基因方面具备诸多显著优势。其一，由于在昆虫细胞内进行复制，其所表达的外源基因产物能够进行如糖基化、磷酸化、折叠以及二硫键形成等各种翻译后修饰，且修饰情况与哺乳动物细胞内相似，这为确保外源基因产物的生物活性提供了有力保障。其二，杆状病毒拥有强启动子，像polh和p10基因属于超量表达基因，其表达贯穿病毒复制周期的晚期至极晚期，其中polh表达产物在病毒感染晚期可达细胞蛋白质总量的25％-50％，这使得polh和p10启动子成为外源基因表达的常用选择。其三，杆状病毒呈棒状且具有可延伸性，基因容量较大，能够容纳更大的病毒基因组。其四，杆状病毒宿主范围局限于昆虫及少数无脊椎动物，每种杆状病毒通常仅能感染一种或少数几种昆虫，对宿主昆虫以外的生物，特别是人类和哺乳动物无感染性，安全性较高。凭借这些优势，昆虫杆状病毒表达系统被广泛应用于在昆虫细胞或昆虫幼虫中生产外源蛋白质，其应用范围涵盖蛋白质结构与功能研究、蛋白质相互作用分析、疫苗生产、疾病诊断以及病毒杀虫剂改良等多个领域。

在利用杆状病毒表达系统生产外源蛋白时，构建重组杆状病毒是关键步骤，而无论采用何种构建方式，最终都需要将重组病毒DNA转染昆虫细胞以产生杆状病毒粒子。当前，将DNA载体（包括Bacmid）转染进昆虫宿主细胞的常用方法有脂质体（lipofectamine）介导的转染法、磷酸钙-DNA共沉淀法、DEAE-葡聚糖介导的转染法和显微注射法。然而，这些传统方法均存在一定的局限性。磷酸钙-DNA共沉淀法虽然成本较低，但对操作要求极为严格，尤其是对pH值的精确度要求极高，pH值的微小变化都可能导致转染效率急剧下降，总体转染效率不高且重复性较差，转染效果不稳定。脂质体介导的转染法操作相对简单，转染效率较高（通常在60-80％之间），但脂质体价格昂贵，实验成本过高，并且在操作时仍需提取和精制DNA后再与脂质体混合，过程较为繁琐。DEAE-葡聚糖作为一种高分子量的多聚阳离子试剂，其转染效率受DNA浓度、细胞数量等多种因素影响，且无法产生稳定的细胞系，目前已较少使用。显微注射法操作过程复杂，需要价值上百万的显微操作系统支持，成本极高，且转染效果与操作者经验密切相关，主要用于单细胞注射试验，难以在普通实验室广泛应用。这些传统转染方法的局限性在很大程度上限制了杆状病毒表达系统的广泛应用和大规模生产重组杆状病毒的效率。

在此背景下，侵染蛋白介导生产重组杆状病毒的方法应运而生，为解决传统方法的困境提供了新的思路。该方法基于独特的原理，通过特定的侵染蛋白帮助携带重组杆状病毒BacmidDNA的细菌直接感染昆虫细胞，从而获得重组病毒粒子。此方法具有显著的优势，它无需提取和纯化BacmidDNA，只需将携带重组Bacmid的细菌与昆虫细胞按一定比例直接混合即可，省去了重组Bacmid的提取、纯化精制以及BacmidDNA与转染试剂混合等复杂的转染程序，极大地简化了操作流程。同时，生产重组病毒的效率得到大幅提升，可达常规转染的4倍，具有经济、快速、高效的特点。这一方法的出现，为大规模构建重组病毒表达外源蛋白奠定了良好的基础，对于推动杆状病毒表达系统在更多领域的应用，以及提高重组蛋白的生产效率和降低生产成本具有重要的现实意义。

1.2研究目的与创新点

本研究旨在深入探究侵染蛋白介导生产重组杆状病毒的方法，通过系统研究和优化相关条件，进一步提高重组杆状病毒的生产效率，以解决传统转染方法在重组杆状病毒生产过程中存在的操作复杂、成本高昂、效率低下等问题，为杆状病毒表达系统的广泛应用提供更高效、经济的技术支持。

本研究的创新点在于充分利用侵染蛋白介导生产重组杆状病毒这一独特技术。该技术打破了传统转染方法依赖复杂转染试剂和繁琐操作流程的局限，通过独特的生物学机制，即利用侵染蛋白帮助携带重组杆状病毒BacmidDNA的细菌直接感染昆虫细胞，实现了从细菌到病毒的一步转化。这种创新方法不仅极大地简化了重组杆状病毒的生产流程，避免了重组Bacmid的提取、纯化精制以及Bac