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猪圆环病毒2型主要抗原位点在毕赤酵母中的分泌表达及免疫原性探究

一、引言

1.1研究背景与意义

猪圆环病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）是引发猪圆环病毒病（Porcinecircovirusdesease，PCVD）的主要病原体，对全球养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2首次于1991年在加拿大被发现，随后在世界各地广泛传播。该病毒粒子呈二十面体对称结构，无囊膜，基因组为单股环状DNA，其病毒粒子直径仅约17nm，是目前已知最小的动物病毒之一。PCV2具有较强的环境抵抗力，在72℃下可存活15分钟，56℃无法将其灭活，且对氯仿、碘酒、酒精等有机物不敏感，这使得其在猪场环境中难以被彻底清除。

PCV2可感染不同年龄的猪，日龄越小，感染后的症状往往越严重。其感染猪群后可引发多种临床症状，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、繁殖障碍、呼吸道疾病、肠道疾病和亚临床感染等。其中，PMWS主要发生在哺乳期和保育期的仔猪，尤其是5-12周龄的仔猪，急性发病猪群的病死率可达10%，若并发或继发其他细菌或病毒感染，死亡率会进一步上升。PCV2感染还会导致猪只生长发育受阻，饲料报酬降低，母猪繁殖障碍，流产率和产死胎率增高，药物费用增加，从而大幅提高了养猪业的生产成本。据相关研究表明，在实验条件下，高病毒血症和中等病毒血症的猪，在21周龄时与平均日增重下降相关的损失，每头猪分别为94.5元和54.1元。目前，PCV2在我国猪场的感染十分普遍，几乎不存在阴性场，阳性猪场率接近100%，已成为制约我国养猪业发展的重要因素之一。

疫苗免疫是防控PCV2感染的关键措施。通过接种疫苗，猪群体内病毒载量可显著降低，能有效改善临床症状，提高日增重和降低料肉比。随着基因工程技术的发展，基因工程苗因其安全稳定，Cap蛋白表达量高，逐渐成为市场主流。然而，目前市场上的PCV2疫苗仍存在一些问题，如部分疫苗的免疫保护效果不够理想，对某些流行毒株的交叉保护能力有限等。因此，研发高效、安全的PCV2疫苗具有重要的现实意义。

毕赤酵母表达系统作为一种优秀的真核表达系统，在重组蛋白表达领域展现出诸多优势。毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母菌，能够利用甲醇作为唯一碳源。该表达系统拥有目前最强、调控机理最严格的启动子之一——醇氧化酶基因AOX1启动子，有利于外源基因的高效表达调控。同时，毕赤酵母具有翻译后的蛋白加工修饰功能，如磷酸化、糖基化等，可对表达的蛋白进行正确折叠和修饰，使其更接近天然蛋白的结构和功能。此外，毕赤酵母还具有培养基成本低廉、培养条件简单、生长繁殖速度迅速、外源基因可单拷贝或多拷贝整合进酵母染色体且遗传稳定性高、适合大规模发酵和高密度培养等优点，非常适合重组真核蛋白的工业放大化生产制备。

本研究聚焦于PCV2主要抗原位点在毕赤酵母中的分泌表达。通过对PCV2主要抗原位点基因的克隆与分析，构建高效表达载体，并将其转化至毕赤酵母中进行分泌表达。旨在利用毕赤酵母表达系统的优势，获得高表达、高活性的PCV2主要抗原蛋白，为PCV2新型疫苗的研发提供关键技术支持和物质基础。这不仅有助于深入了解PCV2的免疫原性和致病机制，还对提高PCV2疫苗的免疫效果、有效防控PCV2感染，进而推动我国养猪业的健康发展具有重要的理论和实践意义。

1.2国内外研究现状

自1991年PCV2被首次发现以来，其在全球范围内的流行态势愈发严峻。在我国，PCV2的感染情况极为普遍，几乎所有猪场都存在不同程度的感染，阳性猪场率接近100%。研究表明，我国PCV2的流行基因型经历了两次重大转变，2000年之前PCV2a为主要流行基因型，2002年后PCV2b取而代之成为优势基因型，2009年之后PCV2d逐渐成为当前的主要流行基因型。PCV2d基因型毒株与其他流行毒株相比，具有更高的同源性，其在猪群中的广泛传播给养猪业带来了沉重打击。

在疫苗研发方面，目前市场上的PCV2疫苗种类繁多，主要包括灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗等。灭活疫苗是最早应用于PCV2防控的疫苗类型，其安全性较高，但免疫效果相对有限，需要多次免疫才能达到较好的保护效果。亚单位疫苗则是通过表达PCV2的主要抗原蛋白，如Cap蛋白，来激发机体的免疫反应。基因工程疫苗因其安全稳定、Cap蛋白表达量高，逐渐成为市场主流。例如，申联生物与南京农业大学等单位联合研发的杆状病毒表达的重组OKM株亚单位疫苗“联圆净”，采用PCV2d型毒株，对ORF2基