DB62T 4094-2020 草品种真实性检验规程 SSR 标记法.docxVIP

ICS65.120

B25

DB62

甘肃省地方标准

DB62/T4094—2020

草品种真实性检验规程SSR标记法

RulesforvarietygenuinenesstestingofherbaceousplantSSRmarkermethod

2020-04-01实施2020-03-16发布

2020-04-01实施

甘肃省市场监督管理局发布

DB62/T4094—2020

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4原理 1

5试验样品 2

6仪器设备及试剂 2

7溶液配制 2

8引物信息 2

9操作程序 2

10数据记录与统计 4

11结果判定方法 4

附录A(规范性附录)主要仪器设备及试剂 5

附录B(规范性附录)溶液配制 7

附录C(规范性附录)引物信息 9

附录D(资料性附录)参照品种信息 12

附录E(规范性附录)凝胶配制 14

附录F(资料性附录)SSR标记电泳图谱 15

附录G(规范性附录)数据统计记录表 21

I

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II

DB62/T40942020

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由甘肃省林业和草原局提出并负责监督实施。

本标准由甘肃省草业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：兰州大学草地农业科技学院，农业农村部牧草与草坪草种子质量监督检验测试中心(兰州),全国畜牧总站，甘肃省草原技术推广总站。

本标准主要起草人：刘文献，谢文刚，闵学阳，齐晓，邵麟惠，陈志宏，向金城。

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草品种真实性检验规程SSR标记法

1范围

本标准规定了利用

本标准规定了利用SSR(SimpleSequeneeRepeat,简单序列重复)标记进行紫花苜蓿(Medicagosativa

及结果判定方法。

2规范性引用文件

3术语和定义

3.1

3.2

参照品种rdrrenevariety

3.3

3.4

基因组中由1～6个核苷酸为基本单位组成的多次简单串联重复序列标记。

4原理

SSR广泛分布于植物基因组的不同位置，且因不同品种间单个SSR位点重复单位数量的不同而存在多态性，是一种应用广泛的DNA分子标记。这种多态性序列两侧的序列高度保守且为单拷贝，可根据其序列设计一对特异引物，通过PCR扩增检测不同样品DNA间的特异片段。因此，根据比较送检样品与比对样品的特异片段可对紫花苜蓿、杂花苜蓿及箭笞豌豆品种进行鉴定。

1

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2

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5试验样品

5.1样品种类

送检样品为种子或叶片组织。

5.2样品的要求

供试样品由委托检验的单位、组织或个人提供，包括送检样品和比对样品。比对样品为已通过审定的品种时，其样品由政府相关管理部门或该部门指定机构提供。比对样品为委托人提供的品种时，检测结果仅表示送检样品与比对样品是否为同一品种，不提供品种真实性判断。

送检样品种子数至少2000粒且发芽率不低于80%。随机选取200粒～300粒送检样品种子，按照GB/T2930.4规定的纸上发芽床方法进行萌发。种子萌发10天后，等量采取40个苜蓿单株或10个箭笞豌豆单株叶组织进行混合(1.0g～2.0g)。当送检样品为生长在大田的叶片组织时，可由扞样员到田间取样。取样的地块由委托检验的单位、组织或个人指定，采用棋盘式取样法，等量采取40个苜蓿单株或10个箭笞豌豆单株叶组织进行混合(1.0g～2.0g),保存于硅胶干燥器或液氮中。每个品种采取2份混合样品。

6仪器设备及试剂

仪器设备及试剂见附录A。

7溶液配制

溶液配制方法见附录B,所用试剂均为分析纯。

8引物信息

引物信息表见附录C。

9操作程序

9.1DNA提取

混合叶组织在液氮中充分研磨后移入2.0mL离心管中。每管加入700μLDNAbuffer溶液，混合均匀，65℃水浴10min,期间颠倒混匀2～3次；冷却至室温，加195μL5MKAc,冰上放置5min。在通风橱内加入600μL24:1氯仿-异戊醇(V:V),颠倒混匀，12000r/