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耐高温天冬氨酸蛋白酶基因工程改造及应用研究

目录

内容概述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4

1.1研究背景与意义．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4

1.1.1天冬氨酸蛋白酶研究现状．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6

1.1.2耐高温蛋白酶的应用价值．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8

1.1.3基因工程改造技术的意义．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11

1.2国内外研究进展．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13

1.2.1耐高温天冬氨酸蛋白酶的来源．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．15

1.2.2耐高温天冬氨酸蛋白酶的特性．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17

1.2.3基因工程改造技术的研究现状．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．18

1.3研究内容与目标．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．19

1.3.1主要研究内容．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．21

1.3.2具体研究目标．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．22

1.4技术路线与研究方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．24

1.4.1实验技术路线．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．28

1.4.2主要研究方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．29

耐高温天冬氨酸蛋白酶的筛选与鉴定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．30

2.1耐高温天冬氨酸蛋白酶的筛选．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．32

2.1.1菌种来源．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．33

2.1.2筛选方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．35

2.2耐高温天冬氨酸蛋白酶的鉴定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．36

2.2.1基因序列分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．37

2.2.2蛋白质结构分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．38

2.2.3酶学特性分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．40

耐高温天冬氨酸蛋白酶的基因工程改造．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．41

3.1基因克隆与表达载体构建．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．46

3.1.1目的基因的克隆．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．49

3.1.2表达载体的构建．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．50

3.2基因突变设计与引物合成．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．52

3.2.1突变位点设计．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．55

3.2.2引物设计与合成．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．58

3.3基因突变体的构建与筛选．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．60

3.3.1基因突变体的构建．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．62

3.3.2突变体筛选．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．64

3.4基因工程菌株的构建与鉴定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．65

3.4.1工程菌株的构建．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．66

3.4.2工程菌株的鉴定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．68

耐高温天冬氨酸蛋白酶改造效果的验证．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．69

4.1重组蛋白酶的表达分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．70

4.1.1表达条件优