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SIRT1调节线粒体自噬对猪肠上皮细胞氧化损伤的影响

摘要

本研究旨在探究SIRT1调节线粒体自噬对猪肠上皮细胞氧化损伤的影响及其潜在机制。通过构建猪肠上皮细胞氧化损伤模型，采用基因过表达与沉默技术调控SIRT1表达水平，运用Westernblot、荧光显微镜等技术检测线粒体自噬相关蛋白表达、线粒体形态及细胞氧化损伤指标。结果表明，SIRT1过表达可显著激活线粒体自噬，减轻猪肠上皮细胞氧化损伤；而SIRT1沉默则抑制线粒体自噬，加重细胞氧化损伤。本研究揭示了SIRT1通过调节线粒体自噬参与猪肠上皮细胞氧化损伤调控的重要作用，为改善猪肠道健康提供了新的理论依据。

关键词

SIRT1；线粒体自噬；猪肠上皮细胞；氧化损伤

一、引言

猪肠道健康是影响养猪业生产效率和经济效益的关键因素。在实际养殖过程中，猪常面临各种应激因素，如高温、高湿、饲料霉变、病原体感染等，这些因素均可诱导猪肠上皮细胞发生氧化损伤，导致肠道屏障功能受损，引发腹泻、生长迟缓等问题。氧化应激产生的过量活性氧（ROS）会攻击细胞内生物大分子，破坏线粒体等细胞器结构与功能，进而影响细胞正常代谢。

线粒体自噬是细胞内一种高度保守的降解机制，通过选择性清除受损线粒体，维持线粒体质量和细胞内环境稳态，在应对氧化应激、保护细胞免受损伤方面发挥重要作用。SIRT1是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，参与细胞衰老、代谢调节、氧化应激反应等多种生物学过程。已有研究表明，SIRT1可通过调节线粒体自噬参与哺乳动物细胞的氧化损伤修复，但在猪肠上皮细胞中的作用尚未明确。因此，深入研究SIRT1调节线粒体自噬对猪肠上皮细胞氧化损伤的影响，对于揭示猪肠道氧化损伤的调控机制、开发有效的防治策略具有重要意义。

二、材料与方法

（一）细胞培养与模型构建

选取猪小肠上皮细胞系IPEC-J2，培养于含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素-链霉素）的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO?培养箱中常规培养。当细胞汇合度达到70%-80%时，用终浓度为100μmol/L的H?O?处理细胞6h，构建猪肠上皮细胞氧化损伤模型。

（二）SIRT1基因调控

将构建好的SIRT1过表达质粒（pcDNA3.1-SIRT1）和SIRT1小干扰RNA（si-SIRT1）分别转染至IPEC-J2细胞，同时设置空质粒转染组（pcDNA3.1）和阴性对照RNA转染组（si-NC）作为对照。转染采用脂质体Lipofectamine3000试剂，按照说明书操作，转染48h后进行后续实验。

（三）检测指标与方法

Westernblot检测：提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。经SDS电泳、转膜后，用5%脱脂奶粉封闭，分别孵育SIRT1、LC3、p62、SOD、MDA等一抗（4℃过夜），次日孵育二抗（室温1h），通过ECL化学发光法显色，ImageJ软件分析蛋白条带灰度值。

线粒体形态观察：采用线粒体特异性荧光探针Mito-TrackerRed对细胞进行染色，在激光共聚焦显微镜下观察线粒体形态变化。

细胞内ROS水平检测：用DCFH-DA探针标记细胞，通过流式细胞仪检测细胞内ROS水平。

细胞活力检测：采用CCK-8法检测细胞活力，按照试剂盒说明书操作，测定450nm处吸光度值。

（四）数据分析

实验数据以“平均值±标准差（x±s）”表示，采用GraphPadPrism8.0软件进行单因素方差分析（One-wayANOVA），组间比较采用Tukey检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

三、结果

（一）H?O?成功构建猪肠上皮细胞氧化损伤模型

与正常对照组相比，H?O?处理组细胞内ROS水平显著升高（P＜0.01），细胞活力显著降低（P＜0.01），MDA含量显著增加（P＜0.01），SOD活性显著降低（P＜0.01），表明H?O?成功诱导猪肠上皮细胞发生氧化损伤。

（二）SIRT1过表达减轻猪肠上皮细胞氧化损伤

与空质粒组相比，SIRT1过表达组细胞内ROS水平显著降低（P＜0.01），细胞活力显著升高（P＜0.01），MDA含量显著减少（P＜0.01），SOD活性显著增强（P＜0.01），表明SIRT1过表达能够有效减轻猪肠上皮细胞氧化损伤。

（三）SIRT1过表达激活线粒体自噬

Westernblot结果显示，与空质粒组相比，SIRT1过表达组LC3-II/LC3-I比值显著升高（P＜0.01），p62蛋白水平显著降低（P＜0.01）；激光共聚焦显微镜观察发现，SIRT