抗体与纯化技术.pptVIP

3-StepPlatformpurification,UNOsphereSUPrACHTUNOsphereQ4123123452450SHPSECBio-SilectSEC400-550mMHEPES0.5MNaCl2Murea,pH7抗体纯化平台2第30页，共35页，星期日，2025年，2月5日*抗体与纯化技术第1页，共35页，星期日，2025年，2月5日抗体纯化平台实验室规模分离纯化抗体技术适用样品特点硫酸铵沉淀血清和腹水无需仪器操作，纯度很低，易聚集，效价受影响，得率很低辛酸沉淀血清和腹水无需仪器操作，纯度较低，不易聚集，效价受影响，得率很低DEAE蓝胶血清和腹水需要仪器，纯度较高，得率较高，成本较低ProteinA/G血清、腹水，细胞培养液需要仪器，纯度很高，得率较高，成本较高治疗用单克隆抗体纯化的可工业放大的实验室研发纯度、得率要求很高，产物必须符合法规规定ProteinAUNOsphere离子交换技术CHT陶瓷羟基磷灰石技术第2页，共35页，星期日，2025年，2月5日抗体纯化平台1实验室规模分离纯化抗体——辛酸沉淀1、基本原理?????在人、羊或兔血清或含有IgG的培养上清中及小鼠的腹水中加入辛酸,可与其中大部分蛋白质形成沉淀，而对IgG的性质没有影响，因此是纯化IgG的有效途径。沉淀后经离心即可获得IgG。辛酸沉淀法与硫酸铵沉淀法比较其主要优点为可减少聚合物的形成，但与其相同，所得的抗体纯度不够，还需用其它方法以进一步提高其纯度。2、操作步骤?s用烧杯加20ml0.06mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.0）到10ml血液、腹水中；s用1NHCl调节pH到4.8，后滴加辛酸同时用力搅拌，辛酸具体用量参见表1；s在室温下继续搅拌30分；s?5，000×g室温离心30分，保留上清；s?用1NNaOH调节pH到5.7；s?含有IgG的上清可以调节pH值后直接上柱精纯，或对PBS透析，然后分装、置-20℃保存。?表1?沉淀不同来源IgG的辛酸参考用量?IgG来源?????????辛酸用量（每10ml血液、腹水或上清）小??鼠??????????????????400μl人???????????????????????700μl羊???????????????????????700μl兔???????????????????????750μl注：必要时需要摸索填加量，以达到最高的纯度和得率。第3页，共35页，星期日，2025年，2月5日抗体纯化平台1实验室规模分离纯化抗体——DEAEAffi-Gel蓝胶Affi-Gel蓝胶DEAE蓝胶CM蓝胶配基CibacronBlueCibacronBlue和DEAECibacronBlue和CM动态载量11mg/mL0.2-1mL血清/ml2-6mL血清/ml建议流速15-25cm/hr15-25cm/hr15-25cm/hr应用去除血清中的HSA一次纯化血清或腹水中的抗体快速去除白蛋白和血纤维蛋白溶酶原Bio-Rad染料亲和介质（蓝胶）交联琼脂糖CibacronBlueDEAE第4页，共35页，星期日，2025年，2月5日Mp1p2p3p4p5p6S抗体纯化平台1实验室规模分离纯化抗体——DEAEAffi-Gel蓝胶一步纯化兔血清抗体－DuoFlow双功能亲和凝胶，含有DEAE和共价结合的CibacronblueF3GA染料，该染料可结合白蛋白、蛋白酶和其它补体蛋白，DEAE基团可结合其余的酸性蛋白。DEAEAffi-Gel蓝胶特性包括:一步纯化血清中IgG，IgG洗脱液中含有少量转铁蛋白IgG洗脱液中无蛋白水解活性ProteinA亲和层析经济的替代品第5页，共35页，星期日，2025年，2月5日抗体纯化平台1实验室规模分离纯化抗体——Affi-Gel,Affi-PrepProteinA纯化抗体亚型Affi-Gel和Affi-PrepProteinA层析介质，可用于获得高纯度的免疫球蛋白(IgG)，尤其哺乳类动物IgG的Fc段结合，功能优势包括:高纯度的IgG与哺乳类动物IgG高亲和性使用MAPSII优化缓冲液，对小鼠IgG及其它亚类具有很高的载量含有Affi-Gel、Affi-PrepProteinA介质和MAPSII缓冲液