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实验四血清球蛋白的提纯

请同学们清洗自己小组以下用品每个小组:层析柱(1支)比色板(2块)玻璃棒(1支)离心管(1支)滴管(2支)烧杯(2个)试管(13支)注意实验过程中每用一次清洗一次！

问题1、血清蛋白质得分类？清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白2、分离纯化蛋白质得方法？电泳、透析及超滤、有机溶剂沉淀、盐析、免疫沉淀、层析、超速离心法等3、盐析？层析？透析？加入中性盐破坏蛋白质稳定因素而使其沉淀(水化膜和电荷层)利用各组分理化性质不同而分离(本实验就是利用组分分子大小不同而分离)半透膜把大小分子分开4、本实验盐析所用硫酸铵饱和度就是多少？33%5、定性检测蛋白质和铵根离子得方法？缩二脲反应(紫红色)或者与磺柳酸反应生成白色沉淀纳氏试剂(黄色或棕色)

一、实验目得1、掌握蛋白质分离纯化方法;2、掌握盐析、凝胶层析、透析法分离纯化蛋白质得基本原理;3、熟悉离心机得操作;4、熟悉蛋白质、NH4+定性检测得方法。

分离纯化蛋白质得方法沉淀法盐析法有机溶剂沉淀法层析法电学法电泳法等电聚焦离子交换层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）亲和层析离心膜分离技术透析超滤

二、实验原理本实验就是应用相同浓度得硫酸铵反复盐析分离血清中得γ-球蛋白,再利用凝胶层析法除盐,即可得到比较纯得γ-球蛋白。采用盐析法分离清蛋白(主要就是清蛋白),再用透析方法除去小分子物质。

二、实验原理(一)盐析(salting-out)定义:加入大量中性盐以破坏蛋白质得稳定因素并使其从溶液中沉淀析出得现象。原理:破坏蛋白质两个稳定因素:水化膜和电荷层中性盐:(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。优点:蛋白质不变性,常用方法。

二、实验原理(二)透析(dialysis)定义:利用半透膜把大小分子分开。透析法就是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜,而大分子物质不能通过半透膜得性质,达到分离得方法。其利用半透膜原理,通过扩散、对流体内各种有害以及多余得代谢废物和过多得电解质移出体外,达到净化血液得目得,并且达到纠正水电解质及酸碱平衡得目得。临床应用:血液透析

二、实验原理(三)层析(chromatography)层析技术就是利用混合物中各组分物理化学性质(如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等)得差别,使各组分在支持物上集中分布在不同区域,借此将各组分分离。按层析得原理不同可以分为:吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析。(教程P25)凝胶就是一类具有三维空间多孔网状结构得物质(分子大小不同)小分子进入凝胶颗粒得微孔中,流程长,下移速度慢;大分子不能进入凝胶颗粒得微孔中去,只能分布在颗粒得间隙中,所以流程短,向下移动速度快。

二、实验原理凝胶层析法(根据分子大小差异而分离)

二、实验原理(四)离心(centrifuge)离心技术就是利用离心力,依据物质得沉降系数、扩散系数和浮力密度差异而进行物质得分离、浓缩和分析得一种技术。

二、实验原理离心操作要领1、根据待离心得溶液性质及体积选择合适得离心管。装载液体时要按各种离心机操作说明进行。无盖离心管不能装得太满。密封得或有盖离心管常要求装满,以免离心管变形。2、检查离心管套筒就是否完好、套筒内有没有软胶垫或棉花。3、精确地平衡离心管及其内容物(配平)。4、平衡后得离心管和内容物(包括套筒)应对称放置。5、启动离心时离心速度由慢到快。

大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静

二、实验原理(五)检测蛋白质、NH4+得方法①检测蛋白质缩二脲试剂:溶液显紫红色20％磺柳酸:有白色沉淀产生②检测NH4+纳氏试剂:黄色或棕色

三、实验操作1、盐析2、透析3、层析(脱盐)4、检测

1、盐析取离心管一支加入血清2ml加入2mlPBS,摇匀逐滴加入pH7、2饱和(NH4)2SO42ml,摇匀上清液(主要含清蛋白)倾入试管中静置10分钟,再离心(2000转/分)10分钟沉淀用1mlPBS搅拌溶解逐滴加饱和(NH4)2SO40、5ml,摇匀倾弃上清液(主要含α、β球蛋白)沉淀即为初步纯化得γ－球蛋白透析脱盐静置10分钟,再离心(2000转/分)10分钟用于配平用于配平样品为猪血清

2、透析清蛋白换水①透析袋刚放入水中时,立即取袋外液体检查有无NH4＋;②每隔4分钟检查一次,共3次,比较NH4＋透出得情况。①约0、5小时,检查袋外液体得NH4＋情况;②取袋外液2滴,置于小试管中,然后滴