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液相色谱法教学课件

液相色谱法发展简史色谱法的历史可追溯至1903年，当时俄国植物学家米哈伊尔·茨维特（MikhailTswett）首次利用石灰石柱分离植物色素，并提出色谱一词。这一创新方法为现代分析化学奠定了基础。20世纪60年代，随着仪器技术的革新，高效液相色谱（HPLC）技术问世，大幅提高了分析速度和灵敏度，彻底改变了分析化学领域。

液相色谱法基本定义基本概念液相色谱法是一种以两相分配为基础的分离分析方法，利用不同物质在固定相与流动相之间分配系数的差异实现分离。分离原理被分离物质在固定相与流动相之间存在动态平衡的分配过程，不同物质因与两相亲和力不同而呈现不同的迁移速率。特征要素

液相色谱法分类介质类型：极性低分离原理：结合力弱介质类型：极性高分离原理：结合力强离子交换色谱：利用离子交换原理排阻色谱：分子大小排斥分离液-液分配色谱：依靠溶剂分配平衡液-固吸附色谱：基于吸附作用分离

液相色谱法与气相色谱法对比液相色谱法（HPLC）适用于不挥发、热不稳定化合物常温操作，温度范围广流动相为液体，复杂度高多种检测器选择分析周期较长气相色谱法（GC）适用于挥发性、热稳定化合物高温操作，通常需加热流动相为气体，操作简便检测器种类相对较少分析速度快

HPLC技术优势高压系统工作压力可达40-50MPa，克服填料阻力，保证流动相稳定流动，提高分离效率高效分离利用细小颗粒填料（3-10μm）提供大表面积，实现高分离度和理论塔板数高灵敏度多种高灵敏度检测器可选，检测限可达纳克（ng）甚至皮克（pg）级别高自动化全自动进样、数据处理系统，减少人为误差，提高分析效率和重现性

HPLC主要应用领域医药分析药物纯度检测、药物代谢产物分析、中药有效成分含量测定、临床样本分析食品安全食品添加剂检测、农药残留分析、营养成分测定、食品真伪鉴别环境监测水质分析、土壤污染物检测、大气颗粒物组分分析、环境激素监测化工领域工业产品质量控制、原料纯度检测、生产过程监控、新产品研发生命科学蛋白质分离纯化、核酸分析、细胞代谢物检测、生物标志物研究

高效液相色谱仪组成总览01贮液器储存和提供流动相，材质需耐腐蚀，配备脱气装置02高压泵提供稳定高压，推动流动相以恒定流速流经系统03梯度系统控制多种流动相的混合比例，实现梯度洗脱04进样器将样品定量注入流动相中，常见有手动和自动两种05色谱柱分离的核心部件，内填固定相，不同物质在此分离06检测器检测分离后的各组分，将信号转换为色谱图数据系统

贮液器与流动相贮液器要求材质必须耐腐蚀，通常采用玻璃或特氟龙材料气密性好，防止空气进入导致基线不稳容量适中，一般为500-1000ml配备过滤器和脱气装置流动相处理必须经过过滤，去除微粒杂质使用前充分脱气，避免气泡干扰高纯溶剂，避免杂质干扰分析现代HPLC系统通常配备多个溶剂贮液器，以满足不同流动相组合的需求。在线脱气系统可有效去除溶剂中的溶解气体，提高分析稳定性。

高压输液泵性能参数流量范围:0.1～10ml/min，精度≤0.5%耐压能力:40～50MPa（400-500bar）脉动小:影响基线稳定性和重现性死体积:应小于0.5ml，避免混合延迟常见泵类型柱塞泵:流量稳定，常配脉冲阻尼器双柱塞泵:减小脉动，提高流量稳定性三柱塞泵:进一步减小脉动，高端仪器常用恒流泵:自动补偿压力变化，保持流速恒定高压泵是HPLC系统的核心部件之一，其性能直接影响分析结果的准确性和重现性。现代高压泵通常采用微处理器控制，能够实现精确的流量控制和压力监测。

梯度洗脱装置梯度洗脱是指在液相色谱分析过程中，流动相组成按预设程序逐渐变化的洗脱方式。相比等度洗脱（流动相组成不变），梯度洗脱能大幅提高复杂样品的分离效率。梯度类型:二元梯度:两种溶剂按比例混合三元梯度:三种溶剂同时参与混合四元梯度:四种溶剂复杂配比，适用于特殊分析梯度形式:线性梯度:溶剂比例线性变化阶梯梯度:溶剂比例阶段性变化凹凸梯度:非线性变化，适应特定分离需求现代HPLC系统常采用高精度双泵实现溶剂极性的梯度变化，能够精确控制不同极性溶剂的混合比例，使复杂样品中极性差异大的组分能够在合理时间内被有效分离。

进样系统1手动进样阀六通阀结构，样品环容积固定（通常5-100μL）。操作简单，成本低，但精度和效率较自动进样器差。2自动进样器可编程控制进样量、进样顺序和时间，提高分析效率和精度。现代仪器标配，可实现无人值守分析。3微量进样技术特殊设计针对稀有样品，可实现纳升级进样，最大限度节约宝贵样品，适用于生物样本分析。进样系统的死体积和重复性对分析结果影响巨大。理想的进样系统应具备良好的密封性、极小的死体积、高度的进样重复性以及与流动相的化学兼容性。

色谱柱结构与材料色谱柱物理结构柱管材质:通常为316L不锈钢，耐高压内径规