炭疽实验室检测技术杨发莲.pptVIP

造成重大的经济损失，严重影响人、畜健康和生产力发展。随着我国市场经济的发展，人民生活需求的提高，饲养畜密度的增加，动物性食品和毛、皮革制品的利用日趋普及，以及土地资源的开发和环境的改造，各类物资的频繁交流，炭疽对我国人民生命安全和财产构成很大威胁，如不采取及时、有效的监控措施，炭疽发病势将有增无减，隐患无穷。鉴于此种传染性疾病在我国仍属一种高、危病种，加以它尚有自外输入我国的潜在可能，在今后加速发展市场经济的的新形势下，加强各级领导对炭疽防制工作的重视和支持，提高广大的基层相关工作人员对炭疽的认识和防病能力，是很有必要的。要做到早发现、早治疗、早控制，必须有相关丰富的流行病学和临床知识外，一定要熟练掌握相关的实验室检测技术。

;二、炭疽病原检验程序

图1示。

;三、血清中炭疽抗体水平检测

（一）意义人血清中炭疽抗体水平检测的意义主要在于下列几个方面：正常人群血清炭疽抗体水平资料收集，特殊人群（产业工人、畜牧人员、实验室人员）血清炭疽抗体水平观察，疫苗接种人群血清炭疽抗体水平分析，患病人群血清炭疽抗体水平研究，在患者标本中未获得炭疽芽胞杆菌阳性检测和分离结果的情况下，血清抗炭疽特异性抗体滴度出现4倍或4倍以上升高也可以结合流行病学线索和临床表现进行确诊。;（二）检测方法目前均为酶联免疫吸附实验（ELISA）

1.标本的采集和保存：发病初期和恢复期（发病后15天左右）各采一次血，血清采集时应尽量避免溶血，因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰读取方法的结果，可造成假阳性，长菌的标本同样的道理易产生假阳性；抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂；标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，使试剂本底加深，一般血清置4℃冰箱5天内完成测试，如需保存一周以上则要-20℃冰冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀，同时避免气泡。;;;;5.终止显色：于各反应孔中加入显色终止液(0.5mol/LH2SO4)0.1mL终止反应。

6.结果判定：实验结果用酶标仪判读，被???孔OD值达阴性血清对照孔OD值的2.1倍时，始可判为阳性。

四、实验项目

（一）标本采集

（二）细菌培养

（三）涂片、G染色、荚膜染色、芽孢染色、光镜检查

（四）噬菌体裂解和青霉素敏感性试验

（五）PCR基因检测

（六）菌种保存;五、实验方法

（一）标本采集

1.采集标本时应遵循的原则:尽可能在抗生素治疗开始前采集标本，除必要时并在具备操作病毒细菌条件的实验室内，不得用解剖的方式获得标本。所需的血液与组织标本，均应以穿刺方式取得。所有标本均置无菌容器中

2.血液标本：所有疑似病例，采取血液标本5-10ml（不加抗凝剂）。

3.皮肤损害处标本：玻片直接在皮肤破损处压蘸；再用棉签采皮肤损害处渗出物，（不加增菌肉汤）。

4.粪便与呕吐物标本：有消化道症状的采粪便或呕吐物标本，注意选取其中混有血液的部分。

5.痰与咽拭子标本：有呼吸道症状的收集痰液及咽拭子标本。;6.脑脊液标本：表现脑膜刺激症状的病人，腰椎穿刺获取脑脊液。

7.尸体标本的采取：可通过穿刺心脏获得血液或穿刺肝脏等实质性脏器获得组织标本。

8.有病死动物接触史可采病死动物标本或相关土壤等环境标本。

（二）细菌分离培养：全部标本均应进行细菌分离培养。

1.标本处理：在生物安全柜内打开装标本的专用容器。在正常情况下应该是无菌的标本，如血液或脑脊液，直接涂布平板，每平板0.1ml左右，组织标本应先以无菌剪刀剪开一断面，在培养基表面压印，然后以接种环涂开。疑似病例的渗出液标本，直接涂布平板后，剩余标本可放入肉汤增菌液中增菌。土壤等有污染或陈旧的标本，均首先制成悬液（土壤等标本经自然沉淀除去粗大沉淀物），10000转／分钟离心5;;;（三）涂片、G染色、荚膜染色、芽孢染色、光镜检查

1.在低倍镜下观察，可见菌落呈卷发状，羊毛状如图3,4示。

2.革兰氏染色阳性，细菌呈链状排列，菌体两端平齐，呈竹节状图5,6,7示。在机体内或特殊培养条件下能形成荚膜，印度墨汁负染时可见菌体周围有肥厚的荚膜，多色美兰染色时菌体染成蓝色、荚膜染成红色。在固体培养基上，于大气条件下可形成芽胞，芽胞体染不上颜色(革兰氏)，位于细菌中央，呈卵圆形，不膨胀图8示；石炭酸复红染色，芽胞为红色，菌体为蓝色图9示。;;;;;;;;;;;（3）脏器（心、肝、脾、肺等），组织标本：用无菌剪