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大丽轮枝菌nep基因沉默表达载体的构建及其转化研究

一、研究背景与意义

大丽轮枝菌是一种极具破坏性的植物病原真菌，能够侵染棉花、番茄、茄子等多种重要经济作物，引发黄萎病。该病具有分布广、危害重、难防治等特点，每年给农业生产造成巨大的经济损失。深入研究大丽轮枝菌的致病机制，寻找有效的防治策略，已成为农业领域的重要课题。

nep基因是大丽轮枝菌中一个与致病性密切相关的基因，其编码的蛋白可能参与了毒素的产生、对宿主植物的侵染过程等。通过对nep基因进行沉默，降低其表达量，有望减弱大丽轮枝菌的致病性，为黄萎病的防治提供新的思路和理论依据。因此，开展大丽轮枝菌nep基因沉默表达载体的构建及其转化研究具有重要的理论价值和实践意义。

二、材料与方法

（一）实验材料

菌株与载体：大丽轮枝菌野生型菌株Vd991，沉默表达载体pSilent-1，大肠杆菌DH5α，农杆菌AGL1。

酶与试剂：限制性内切酶（BamHⅠ、HindⅢ等）、T4DNA连接酶、DNA聚合酶、质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒等。

培养基：PDA培养基（用于大丽轮枝菌培养）、LB培养基（用于大肠杆菌培养）、YEB培养基（用于农杆菌培养）等。

引物：根据大丽轮枝菌nep基因序列及沉默载体pSilent-1的多克隆位点，设计用于扩增nep基因干扰片段的引物，引物两端分别引入相应的酶切位点。

（二）实验方法

nep基因干扰片段的获取

（1）提取大丽轮枝菌野生型菌株Vd991的基因组DNA。

（2）以基因组DNA为模板，利用设计好的引物进行PCR扩增，获取nep基因的干扰片段。PCR反应体系为：模板DNA1μL，上、下游引物各1μL，DNA聚合酶0.5μL，dNTPs2μL，10×PCR缓冲液5μL，ddH?O补至50μL。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min。

（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并用DNA回收试剂盒回收目的片段。

沉默表达载体的构建

（1）用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ分别对回收的nep基因干扰片段和pSilent-1载体进行双酶切。酶切体系为：目的片段/载体10μL，10×酶切缓冲液2μL，两种限制性内切酶各1μL，ddH?O补至20μL，37℃酶切3h。

（2）酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收酶切后的nep基因干扰片段和pSilent-1载体骨架。

（3）用T4DNA连接酶将酶切后的nep基因干扰片段与pSilent-1载体骨架连接。连接体系为：载体骨架4μL，目的片段6μL，T4DNA连接酶1μL，10×连接缓冲液1μL，16℃连接过夜。

（4）将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜。

（5）挑取单菌落进行培养，提取质粒，通过双酶切和测序验证重组载体是否构建成功，将成功构建的载体命名为pSilent-nep。

大丽轮枝菌的转化

（1）采用农杆菌介导的转化方法。将重组载体pSilent-nep转化至农杆菌AGL1感受态细胞中，通过抗性筛选和PCR验证获得阳性农杆菌菌株。

（2）培养大丽轮枝菌Vd991的分生孢子，将其与阳性农杆菌菌株共培养于含乙酰丁香酮的诱导培养基上，25℃培养2-3d。

（3）将共培养后的混合物涂布于含潮霉素和头孢霉素的PDA固体培养基上，25℃培养，进行转化子的筛选。

转化子的鉴定

（1）挑取筛选得到的转化子进行培养，提取其基因组DNA，通过PCR扩增检测nep基因干扰片段是否整合到大丽轮枝菌基因组中。

（2）提取转化子的RNA，反转录为cDNA，采用RT-PCR检测nep基因的表达量，以未转化的野生型菌株为对照，分析基因沉默效率。

（3）对沉默效率较高的转化子进行致病性测定，将其接种到寄主植物上，观察发病情况，与野生型菌株进行比较，分析nep基因沉默对大丽轮枝菌致病性的影响。

三、结果与分析

（一）nep基因干扰片段的获取

通过PCR扩增得到了与预期大小相符的nep基因干扰片段，琼脂糖凝胶电泳显示片段清晰，无杂带，回收后可用于后续的载体构建。

（二）沉默表达载体的构建

重组载体pSilent-nep经双酶切鉴定，得到了与目的片段和载体骨架大小相符的两条带，测序结果表明nep基因干扰片段正确插入到pSilent-1载体中，且序列无误，说明沉默表达载体构建成功。

（三）大丽轮枝菌的转化与转