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ELISA实验检测原理及操作步骤

酶联免疫吸附测定（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）作为一种经典的免疫检测技术，凭借其高度的特异性、灵敏性以及操作的相对简便性，在生命科学研究、临床诊断、药物研发及食品安全等多个领域均占据着不可或缺的地位。其核心在于将抗原抗体的特异性免疫反应与酶的高效催化作用相结合，通过酶对底物的催化显色反应来间接反映待测物的存在与含量。

一、ELISA实验检测原理

ELISA的基本原理是基于抗原（Antigen,Ag）与抗体（Antibody,Ab）之间高度特异性的结合反应。在实验设计中，通常会将其中一种反应物（抗原或抗体）固定于固相载体（如聚苯乙烯微量反应板的孔）表面，这个过程称为“包被”。随后，加入含有待测物（可能是抗原或抗体）的样本，使其与固相上的反应物发生特异性结合。接着，再加入一种酶标记的抗体或抗原（称为酶结合物），该酶结合物能与已形成的免疫复合物特异性结合。最后，加入酶的底物，酶会催化底物发生化学反应，产生可检测的有色产物（或其他信号）。产物的量与待测物的浓度在一定范围内呈正相关，通过检测产物的吸光度（或其他信号强度），即可对待测物进行定性或定量分析。

具体而言，ELISA的核心要素包括：

1.抗原抗体特异性结合：这是ELISA的基础，确保了检测的高度特异性。

2.酶标记技术：将酶分子与抗体或抗原共价连接，形成酶结合物。常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（ALP）等。

3.显色反应与信号检测：酶结合物中的酶能催化特定的无色底物发生反应，生成有色产物。通过酶标仪等设备检测产物的吸光度，将免疫反应的结果转化为可量化的信号。

二、ELISA实验操作步骤

ELISA的操作流程严谨且细致，每一步的操作规范都直接影响实验结果的准确性与重复性。以下以最常见的间接法ELISA（用于检测样本中的抗体）为例，详细介绍其标准操作步骤。

（一）实验准备与试剂平衡

实验开始前，需将所有试剂盒组分（包括标准品、酶结合物、底物、洗涤液、终止液等）从冷藏环境中取出，在室温下平衡适当时间（通常为30分钟至1小时，具体参照试剂盒说明书）。同时，根据试剂盒说明书的要求，配制所需浓度的洗涤液（通常为浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释）。准备好干净的微量反应板、移液器、吸头、计时器、湿盒以及酶标仪等。

（二）包被（Coating）

包被是将抗原固定于固相载体表面的过程。

1.用包被缓冲液（通常为碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，pH值特定）将已知抗原稀释至适当浓度。

2.用移液器向微量反应板的每个孔中加入一定体积（通常为100-200μL）的稀释抗原溶液。

3.将反应板加盖或用保鲜膜封好，置于适当温度（通常为4℃过夜或37℃温育1-2小时）下进行孵育，使抗原充分吸附于孔壁。

4.孵育结束后，弃去孔内液体，进行洗涤。

（三）封闭（Blocking）

包被后，反应孔表面除了特异性结合抗原的位点外，仍有许多未被占据的疏水基团，这些基团可能会非特异性地吸附后续加入的蛋白质（如抗体、酶结合物），导致背景升高。封闭的目的就是用一种无关的蛋白质（如牛血清白蛋白BSA、脱脂奶粉等）将这些位点封闭。

1.向每个反应孔中加入适量的封闭液（通常为含1-5%BSA或脱脂奶粉的缓冲液），确保完全覆盖孔底。

2.室温或37℃孵育适当时间（通常为30分钟至1小时）。

3.孵育结束后，弃去封闭液，用洗涤液进行洗涤。

（四）洗涤（Washing）

洗涤是ELISA操作中至关重要的步骤，贯穿于各个孵育步骤之后，其目的是去除未结合的游离反应物（如未结合的抗体、酶结合物等），降低非特异性背景。

1.通常使用多通道移液器或洗板机向每个孔中加入足量洗涤液（如300μL/孔），静置数十秒（如30-60秒）。

2.将反应板倒扣在吸水纸上，彻底拍干孔内液体。

3.重复上述洗涤步骤3-5次，具体次数参照试剂盒说明书。

（五）加样（样本与标准品）

1.标准品加样：将系列稀释的标准品（已知浓度的抗体）按照浓度梯度依次加入到反应板的相应孔中，每孔加入规定体积（通常为100μL）。标准品用于绘制标准曲线，以便对待测样本进行定量。

2.样本加样：将待检测样本（如血清、血浆、细胞培养上清等）按照说明书要求进行适当稀释（若需要），然后加入到剩余的反应孔中，每孔加入同样体积。同时，设置阴性对照孔（如正常血清或样本稀释液）和空白对照孔（通常只加样本稀释液或洗涤液）。

3.轻轻振荡反应板，使孔内液体混合均匀。

4.将反应板加盖，置于37℃温育适当时间（通常为30分钟至1小时），使样本中的抗体与固相上的抗原充分结合。

（六）孵育后洗涤

同步骤（四），彻底洗涤以去除未与固相抗原结合的游离