荧光免疫技术原理与荧光物质特性概述.pdfVIP

第八章荧光免疫技术

第一节概述

荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。

一、荧光的基本知识

1.荧光：某些物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内出的波长大于激发光波长的光。

2.光谱：固定激发光波长，在不同波长下所记录到的样品所的荧光强度谱图。激发态电子回

到的能级不同，发出的荧光波长就不同。

3.激发光谱：固定检测光荧光波长，用不同波长的激发光照射样品所记录到的相应的荧光强

度谱图。

4.荧光效率：荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率称为荧光效率。在一定范围内，荧光强度与激

发光强度呈正相关，即激发光越强，荧光越强，但过强的激发光会使荧光很快褪去。

5.荧光：荧光物质被激发后产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间称为荧光。

-

6.荧光淬灭：荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、苯胺、酚、I、等）作用下，发

射荧光减弱甚至消退，称为荧光淬灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以

荧光的形式。

7.荧光偏振。

二、荧光物质

（一）荧光色素

1.异硫酸荧光素（FITC）：呈现明亮的黄绿色荧光。

2.四乙基RB200）：呈橘红色荧光。

3.四甲基异硫酸TRITC）：呈橙红色荧光。

4.藻红蛋白（R-RE）：呈明亮的橙色荧光。

（二）其他荧光物质

3＋3＋

1.镧系螯合物：其中以Eu应用最广。Eu螯合物的激发光波长范围宽，光波长范围窄，荧光衰变

时间长，最适合用于时间分辨荧光免疫测定。

2.酶作用后产生荧光的物质：4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷本身无荧光，受β-半乳糖苷酶的作用分解成

4-甲基伞酮，后者可发出荧光。其他如碱性磷酸酶的底物是4-甲基伞酮磷酸盐，辣根过氧化物酶的底物是

对羟基苯乙酸等。

第二节荧光抗体技术

一、荧光抗体的

（一）抗体要求

将荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成。一般需经纯化提取IgG后再作标记。

（二）荧光素要求异硫酸荧光素最常用

要求：

①应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降

解产物易于清除；

②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率；

③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；

④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质；

Chapter8Fluorescence

Immunotechnology

Section1

Overview

Fluorescenceimmunoassaytechnologyistheearliestdevelopedtypeof

labelingimmunoassaytechnology.

1.Basicknowledgeoffluorescence

1.Fluorescence:Whencertainsubstancesareexcitedbylightofacertainwavelength,theyemitlightwithawavelengthgreaterthanthewavelengthoftheexcitationlightinaverys