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医用细胞培养操作规程

###一、概述

医用细胞培养是生物医学研究和制药领域的基础技术，广泛应用于药物筛选、疾病模型构建和细胞治疗等方面。为确保细胞培养过程的标准化、高效性和安全性，本规程规定了医用细胞培养的操作步骤、质量控制要点及注意事项。操作人员需严格遵守本规程，以保障细胞实验的准确性和可重复性。

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###二、操作准备

####（一）设备与耗材

1.**设备**

-超净工作台：洁净度达到ISOClass5级以上。

-CO?培养箱：温度36±1℃，CO?浓度5±0.5%。

-生物安全柜：用于无菌操作和样品处理。

-电子天平：精度0.1mg。

-离心机：转速范围1000–5000rpm。

-恒温水浴锅：温度范围37±0.5℃。

2.**耗材**

-细胞培养瓶/皿：材质为聚乙烯或聚丙烯，需预消毒。

-培养基：根据细胞类型选择合适的完全培养基（含血清、双抗等）。

-PBS缓冲液：无菌生理盐水，pH7.4。

-无菌吸头、移液器、酶消化液（如0.25%胰蛋白酶）。

-细胞计数板、显微镜。

####（二）环境要求

1.**环境清洁**：操作前需对超净工作台进行紫外线消毒30分钟，并开启通风。

2.**手卫生**：操作前用70–75%乙醇消毒双手。

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###三、细胞培养操作步骤

####（一）细胞复苏

1.**解冻步骤**

-将细胞冻存管放入37℃水浴中快速解冻（1分钟）。

-吸出冻存液，加入含血清的培养基重悬细胞。

2.**计数与接种**

-使用细胞计数板或流式细胞仪计数细胞密度，调整细胞悬液浓度至1×10?–1×10?cells/mL。

-将细胞接种至培养瓶，密度根据细胞类型调整（如adherent细胞接种1×10?cells/cm2）。

####（二）细胞传代

1.**消化处理**

-观察细胞生长至80–90%汇合度时，弃培养基，加入3–5mL酶消化液（如胰蛋白酶）。

-静置1–5分钟（贴壁细胞），显微镜下观察细胞变圆即可终止消化（加入培养基中和）。

2.**收集与重悬**

-吸起细胞悬液，加入适量培养基（如2–3mL），吹打均匀。

-计数细胞，按需分装至新的培养瓶。

####（三）日常维护

1.**培养基更换**

-每2–3天更换培养基，首次传代后可延长至3–5天。

-弃去培养基前需观察有无污染（如浑浊、颜色异常）。

2.**CO?调节**

-确保培养箱CO?浓度维持在5±0.5%，避免过高或过低影响pH值。

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###四、质量控制要点

####（一）无菌控制

1.所有操作需在超净工作台或生物安全柜内进行。

2.耗材需经高压蒸汽灭菌（121℃，15分钟）或过滤除菌（0.22μm膜）。

####（二）细胞状态监测

1.每日显微镜观察细胞形态、生长状态及有无污染（细菌、真菌）。

2.定期检测细胞活力（如MTT法），活力应95%。

####（三）实验记录

1.记录细胞复苏日期、传代次数、培养基成分及更换频率。

2.异常情况（如污染、生长停滞）需及时记录并分析原因。

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###五、注意事项

1.操作过程中避免接触非无菌区域，减少气溶胶传播。

2.移液器头需一次性使用，避免交叉污染。

3.细胞冻存时，冻存液含DMSO浓度需根据细胞类型调整（通常5–10%）。

4.处理废弃细胞及耗材需符合生物安全废物处理规定。

本规程为通用操作指南，具体实验需根据细胞类型及实验目的调整参数。

###一、概述

医用细胞培养是生物医学研究和制药领域的基础技术，广泛应用于药物筛选、疾病模型构建和细胞治疗等方面。为确保细胞培养过程的标准化、高效性和安全性，本规程规定了医用细胞培养的操作步骤、质量控制要点及注意事项。操作人员需严格遵守本规程，以保障细胞实验的准确性和可重复性。

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###二、操作准备

####（一）设备与耗材

1.**设备**

-超净工作台：洁净度达到ISOClass5级以上，需定期进行紫外灯消毒和气流测试，确保工作环境无菌。

-CO?培养箱：温度36±1℃，CO?浓度5±0.5%，需定期校准CO?传感器和温湿度计，避免因设备故障影响细胞生长。

-生物安全柜：用于无菌操作和样品处理，使用前需进行泄漏测试和风速检查。

-电子天平：精度0.1mg，用于精确称量培养基、血清等试剂。

-离心机：转速范围1000–5000rpm，需定期校准转子，确保离心力准确。

-恒温水浴锅：温度范围37±0.5℃，用于酶消化、细胞洗涤等操作，需定期校准温度探头。

-细胞计数板、显微镜：用于观察细胞形态和计数，需定期清洁和校准。

2.**耗材**

-细胞培养瓶/皿：材质为聚乙烯或聚丙烯，需预消毒，避免使