免疫学病毒学实验操作流程.docxVIP

免疫学病毒学实验操作流程

一、实验准备阶段

（一）实验前准备

1.个人防护：穿戴实验服、手套、护目镜，必要时佩戴口罩。

2.仪器设备：检查离心机、培养箱、显微镜等设备是否运行正常。

3.试剂耗材：确认病毒培养液、细胞培养基、胰蛋白酶等试剂在有效期内，并按要求配置。

4.样本处理：收集待检测样本，按照规范进行保存和前处理。

（二）实验环境要求

1.洁净度：实验应在生物安全柜或超净工作台中完成，确保环境无菌。

2.温湿度：培养箱温度维持在37℃±1℃，相对湿度控制在50%-60%。

3.消毒措施：实验台面、器械使用前后需用75%酒精擦拭消毒。

二、病毒培养操作

（一）细胞培养

1.种板准备：(1)取细胞冻存管，解冻后置于37℃水浴5分钟；(2)将细胞悬液接种于96孔板，每孔100-200μL；(3)置于培养箱中静置30-60分钟使细胞贴壁。

2.细胞传代：(1)用胰蛋白酶消化旧培养液，显微镜下观察细胞80%-90%融合时进行传代；(2)用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2次，加入新鲜培养基。

（二）病毒感染

1.病毒稀释：取病毒原液，用细胞培养基系列稀释至合适MOI（感染复数），如MOI=0.1-0.5；

2.感染操作：(1)弃去旧培养基，PBS冲洗1次；(2)加入稀释后的病毒悬液，37℃吸附1-2小时；(3)补充新鲜培养基继续培养。

三、实验观察与检测

（一）形态学观察

1.显微镜检查：(1)24-48小时后观察细胞病变（CPE），记录蚀斑形成情况；(2)高倍镜下拍摄细胞形态变化，注意病毒包涵体特征。

2.图片采集：使用细胞成像系统拍摄，保存DIC或相差显微镜图像。

（二）定量检测

1.蚀斑测定：(1)收集培养液，铺琼脂overlay；(2)37℃培养3-5天，计数蚀斑数，计算病毒滴度（PFU/mL）；

2.ELISA检测：(1)收集细胞裂解液，用标准曲线法测定病毒抗原含量；(2)结果计算公式：Viraltiter（pg/mL）=（样本OD值-空白值）/（标准品OD值-空白值）×标准品浓度。

四、实验数据处理

（一）数据记录

1.建立实验记录表，包含日期、样本编号、MOI、CPE等级、病毒滴度等信息；

2.使用电子表格软件（如Excel）建立数据汇总表。

（二）结果分析

1.CPE分级标准：(1)0级：无病变；(2)1级：10%以下细胞变圆；(3)2级：10%-30%细胞变圆；

2.统计分析：采用GraphPadPrism软件进行差异检验，p0.05认为有统计学意义。

五、实验废弃物处理

（一）分类收集

1.一次性耗材：直接投入医疗垃圾收集桶；

2.液体废弃物：用50mL/L有效氯消毒30分钟后排放。

（二）设备清洁

1.生物安全柜：每日用70%酒精擦拭内壁；

2.离心机转子：使用后立即用消毒液浸泡30分钟。

**一、实验准备阶段**

（一）实验前准备

1.**个人防护：**

(1)严格按照标准穿戴实验服，确保衣袖束紧，无破洞。

(2)佩戴一次性手套，操作过程中避免触摸面部、眼睛及非操作区域，如需调整需更换手套。

(3)根据实验需求，佩戴合适的护目镜或面屏，防止飞溅物损伤。

(4)在可能产生气溶胶的操作（如高压灭菌、某些细胞裂解）时，佩戴口罩。

2.**仪器设备：**

(1)**离心机：**检查转子是否完好无损，转速范围是否满足实验需求，离心前确保腔体内无残留液体，平衡好样品管。

(2)**培养箱：**检查温度控制器是否准确（使用标准温度计校准），箱内照明、湿度控制是否正常，内部是否清洁干燥。

(3)**显微镜：**检查光源亮度、对焦是否清晰，物镜和目镜清洁度，必要时使用清洁液擦拭。

(4)**移液器：**检查各量程移液器是否精准，活塞动作是否顺畅，无漏液现象，必要时用专用校准液进行校准。

(5)**高压灭菌锅：**检查压力表、温度计是否正常，灭菌程序是否设置正确，锅体内外是否清洁。

3.**试剂耗材：**

(1)**核对试剂：**检查所有试剂标签是否清晰，名称、规格、生产日期、有效期是否明确，储存条件是否正确（如2-8℃、-20℃、-80℃）。

(2)**配置培养基：**按照标准操作规程（SOP）配制细胞培养基（如DMEM/F12+10%FBS+1%P/S），确保无菌操作，配置后分装于无菌冻存管，高压灭菌。

(3)**准备病毒保存液：**根据病毒类型选择合适的保存液（如DulbeccosPBS、MEM培养基等），必要时加入青霉素-链霉素等抗生素。

(4)**其他耗材：**准备好无菌的96孔/24孔细胞培养板、培养皿、移液管吸头、枪头、无菌滤膜（如0.22μm）、PBS、胰蛋白酶（含EDTA