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化脓隐秘杆菌溶血素单克隆抗体：解锁蛋白结构奥秘的关键钥匙

一、引言

1.1研究背景

1.1.1化脓隐秘杆菌及其危害

化脓隐秘杆菌（Trueperellapyogenes），曾用名Arcanobacteriumpyogenes，是一种广泛存在于动物体内的条件性致病菌，近年来在人类感染病例中也逐渐被发现。该菌为革兰氏阳性杆菌，无芽孢、无鞭毛，常呈短链或单个排列。其生长条件为需氧或兼性厌氧，在血琼脂平板上可形成灰白色、不透明的小菌落，常伴有β-溶血环（完全溶血）。生化特性表现为能发酵葡萄糖、麦芽糖等糖类，不发酵甘露醇，触酶阴性。

化脓隐秘杆菌主要寄生于动物的口腔、肠道和生殖道中，是正常菌群的一部分。但在特定条件下，如动物免疫力低下、饲养环境差或外伤未及时处理时，它可导致多种化脓性感染。在家畜中，牛感染后常引发乳腺炎、子宫内膜炎和腐蹄病等。奶牛的子宫内膜炎不仅会降低奶牛的繁殖能力，还会影响牛奶的质量和产量，给乳业带来重大经济损失。猪感染后易出现关节炎、肺炎和脓肿等症状，影响猪的生长发育，降低养殖效益。羊感染后可患化脓性淋巴结炎、败血症等疾病，严重威胁羊群健康。

除了家畜，化脓隐秘杆菌还能感染野生动物，如白尾鹿的颅内化脓性脑膜炎就与该菌有关，白尾鹿还可能作为保藏宿主，对家畜构成潜在威胁。在伴侣动物中，猫的外耳道炎以及犬的膀胱炎中也有分离到该菌的报道。人类感染化脓隐秘杆菌虽偶发，但后果严重，可引起伤口感染，如皮肤脓肿、蜂窝织炎；深部感染如败血症、心内膜炎、骨髓炎等，对人类健康构成威胁。

1.1.2溶血素在化脓隐秘杆菌致病中的关键地位

溶血素（Pyolysin,PLO）是化脓隐秘杆菌最主要的毒力因子，是一种胆固醇依赖的细胞毒素（Cholesterol-dependentcytolysin，CDCs）。它最早于1996年被纯化出来，能够溶解红细胞，还对巨噬细胞、中性粒细胞、上皮细胞、成纤维细胞及子宫内膜基质细胞等多种宿主细胞发挥破坏作用。其作用机制是与细胞膜结合并形成跨膜小孔，从而破坏宿主细胞膜的完整性，导致细胞破碎死亡。研究表明，PLO表达缺陷的化脓隐秘杆菌菌株感染小鼠时，表现出较差的感染性及致病性，而PLO特异的抗体可以完全中和化脓隐秘杆菌的溶血活性，这充分说明了PLO在该菌致病过程中的关键作用。

腹腔或静脉注射PLO，可导致小鼠和兔子死亡，使豚鼠出现皮肤坏死。在化脓隐秘杆菌感染宿主的过程中，溶血素通过破坏免疫细胞，削弱宿主的免疫防御能力，促进细菌的扩散。它还能破坏组织细胞，导致炎症和脓肿的形成，在化脓隐秘杆菌引发的各种疾病中起着核心作用。深入研究溶血素的结构和功能，对于理解化脓隐秘杆菌的致病机制至关重要。

1.2单克隆抗体技术概述

1.2.1单克隆抗体的制备原理与过程

单克隆抗体的制备基于杂交瘤技术，其原理是将能产生特异性抗体的B淋巴细胞与无抗原特异性但能永久增殖的骨髓瘤细胞进行融合。B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力，但B细胞在体外不能长期存活，无法大量制备单一B淋巴细胞群和单抗。而骨髓瘤细胞不具备分泌抗体的能力，却可以在体外培养条件下无限繁殖。将二者融合成杂交瘤细胞后，杂交细胞具备双亲细胞的遗传特性，既能像B淋巴细胞一样分泌抗体，又能像骨髓瘤细胞一样无限增殖。

具体制备过程如下：首先是免疫动物，一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，用目的抗原按照预先制定的免疫方案进行免疫注射，使小鼠产生致敏B淋巴细胞。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。接着进行细胞融合，采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

融合后需要进行选择性培养，目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡；未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡；只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。之后，还需对杂交瘤阳性克隆进行筛选与克隆化，通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养，采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。最后，对单克隆