DB37_T 4415-2021 β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中β-乳球蛋白的检测技术.docxVIP

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山东省地方标准

DB37/T4415—2021

β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中

β-乳球蛋白的检测技术

Detectionofβ-lactoglobulingeneknockoutcowandβ-lactoglobulinincowsmilk

2021-10-18发布

2021-11-18实施

山东省市场监督管理局发布

I

DB37/T4415—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。

本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

本文件起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、中国农业大学、山东奥克斯畜牧种业有限公司、蒙天乳业有限公司、山东省畜牧总站。

本文件主要起草人：黄金明、戴蕴平、魏晓超、丁芳荣、王秀革、鞠志花、姜强、胡智胜、张亚冉、高亚平、刘文浩、王金鹏、杨春红、李彦芹、宋明智、高运东、侯明海。

DB37/T4415—2021

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β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中β-乳球蛋白的检测技术

1范围

本文件确立了β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛的定性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法，以及牛奶中β-乳球蛋白（BLG）的定性免疫印迹（Western-Blot）和定量酶联免疫吸附（ELISA）检测方法。

本文件适用于β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛以及牛奶中β-乳球蛋白的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

GB/T

27642—2011

牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法

NY/T

1663—2008

乳与乳制品中β-乳球蛋白的测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法

NY/T

1672—2008

绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程

NY/T

2695—2015

牛遗传缺陷基因检测技术规程

SN/T2497.16—2010进出口危险化学品安全试验方法第16部分：Western-Blot实验

农业部2031号公告-14-2013转基因动物及其产品成分检测普通牛(Bostaurus)内标准基因定性PCR方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

牛β-乳球蛋白基因Bostaurusβ-lactoglobulinBLG

BLG基因（NCBIReferencesequence:NC_037338.1），简称PAEP，来源于普通牛（Bostaurus），编码β-乳球蛋白的基因。

注：基因全长4900bp，由7个外显子和6个内含子组成，编码252个氨基酸。

3.2

β-乳球蛋白基因敲除奶牛β-lactoglobulinknockoutcow

利用基因编辑技术敲除β-乳球蛋白基因的奶牛。

4聚合酶链式反应（PCR）法-基因定性检测

4.1原理

通过设计特异引物，扩增出包含牛BLG基因全长的DNA片段，对扩增产物进行测序分析。依据BLG基因编码序列是否发生突变，并提前引入终止密码子，造成蛋白质编码异常，判断是否敲除BLG基因。

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4.2试剂或材料

除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

4.2.1水：GB/T6682，三级。

4.2.250×TAE缓冲液：称取Tris-base242.2g，加入冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)100mL，用水定容至1000mL。使用时，用水稀释为1×TAE。

4.2.31%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖充分溶解于1×TAE，定容至100mL。

4.2.4BLG基因引物：

——上游引物：5′-GCCTCTCGCATCTGACACTT-3′；

——下游引物：5′-AGTTTCAAAGAGCCGTAGATGTGTG-3′；

——预测野生型扩增片段大小为6728bp。

4.2.5内标准基因引物：参照农业部2031号公告-14-2013。

4.2.6引物溶液：引物用水稀释