T_NAIA 0311-2024 支原体中西药MIC检测标准操作规程.docxVIP

ICS65.020.30

CCSA031

T/NAIA

团体标准

T/NAIA0311—2024

支原体中西药MIC检测标准操作规程

StandardOperatingProceduresforMICDetectionofMycoplasmainTraditionalChineseandWesternMedicine

2024-10-02发布2024-10-20实施

宁夏化学分析测试协会发布

I

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。

本文件起草单位：宁夏农林科学院动物科学研究所、银川市畜牧技术推广服务中心、西吉县动物疾病预防控制中心、同心县科技局、隆德县动物疾病预防控制中心、固原市畜牧技术推广服务中心、平罗县农业农村局。

本文件主要起草人：郭亚男、王小龙、曹晓真、王建东、梁小军、邵喜成、伏耀明、马科、谢文青、摆世林、于有利、张久盘、张奎举、谢建亮、李毓华、岳康、王鑫、牛晓昊。

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支原体中西药MIC检测标准操作规程

1范围

本文件规定了支原体中药和西药最小抑菌浓度检测技术的术语和定义、原理、标准操作规程、结果判断依据和操作注意事项。

本文件适用于鸡、牛和羊支原体。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB18597危险废物贮存污染控制标准

CLSIM100-S22抗生素敏感性检测操作标准

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1

支原体mycoplasma

柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属中的成员，结构较简单，无细胞壁，没有细胞核，仅有核糖体。

3.2

最小抑菌浓度minimuminhibitoryconcentration(MIC)

一种在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度，用于定量测定体外抗菌活性。

3.3

颜色变化单位colorchangeunit(CCU)

以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的计数单位。

3.4

胸膜肺炎样微生物培养基pleuropnenmonia-likeorganismmediumPPLO

即支原体培养基，主要用于多种支原体的分离和培养。

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4原理

支原体在PPLO培养基中生长产酸，将导致培养基颜色由红色变为黄色。当药物在培养基内能够对支原体的生长起到一定的抑制或杀灭作用时，培养基将维持红色。将药物进行倍比稀释测定支原体对药物的敏感性。药物完全抑制支原体生长的最高稀释管1mL所含的药量，即为最小抑菌浓度（MIC），亦即被测支原体对该药的敏感度。

5操作程序

5.1仪器与耗材

生物安全柜，二氧化碳培养箱，旋转蒸发仪，电磁炉，0.2mL无菌12连管，2mL无菌EP管，涡旋仪，冰箱，天平，高压消毒锅，移液器及枪头，0.22μm微孔滤膜。

5.2操作步骤

5.2.1药液的制备

西药配置

根据药物特性，用相应溶剂将抗菌药物溶解，然后用去离子水将药物稀释成1mg/mL的储存液，～80℃保存。使用前将储存液使用去离子水稀释至所需工作液浓度，0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。不同药物配置参照CLSIM100-S22执行。

中药配置

首先以10倍量水浸泡0.5h，大火沸腾后文火煎煮40min，过滤，保存滤液；滤渣再以8倍水量大火沸腾后文火煎煮30min，过滤，合并两次滤液，将滤液浓缩制成生药含量为1g/mL的浓缩液，-80℃保存。使用前将储存液使用去离子水稀释至所需工作液浓度，0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。

5.2.2菌株复苏、传代及CCU的测定

将保存于-80℃含30%甘油的分离鉴定的支原体菌株的菌液吸取100μL接种于PPLO液体培养基中,置于37℃培养箱中进行复苏，培养48h～72h后吸取100μL菌液接种于PPLO液体培养基中进行传代培养，并测定菌株培养后的CCU。

将支原体菌液用倍比稀释法稀释成1×101～1×1011倍比稀释液（共11管，第12管为对照），于37℃培养箱