ABIVeriti梯度PCR仪使用说明.docxVIP

ABIVeriti梯度PCR仪使用说明

引言

ABIVeriti梯度PCR仪作为一款在分子生物学实验室中广泛应用的精密仪器，其卓越的温度控制性能与梯度功能为PCR反应条件的优化及高通量实验提供了坚实保障。本使用说明旨在为操作者提供一套系统、规范的操作指引，以确保实验结果的准确性、重复性，并延长仪器的使用寿命。请在操作前仔细阅读本说明，并严格遵循各项操作规程。

一、操作前准备

1.1实验环境与台面整理

确保操作台面洁净、水平、稳固，远离水源、火源及腐蚀性气体。实验前应使用75%乙醇擦拭台面及仪器表面，营造无菌操作环境。同时，确认仪器周围留有足够空间以保证散热良好，避免阳光直射或空调出风口直吹。

1.2仪器状态检查

检查仪器电源线连接是否稳固，电源插座是否接地良好。观察仪器外观有无明显损坏，散热孔是否通畅无堵塞。打开仪器电源前，确认样品槽内无异物，热盖处于关闭但未锁紧状态。

1.3试剂与耗材准备

根据实验需求，提前准备好PCR反应所需的各种试剂（如DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液等）及无菌无酶的PCR管或96孔PCR板、配套的光学封板膜或盖子。所有试剂均应按照其储存条件妥善保存，并在使用前按要求进行解冻和混匀。

1.4个人防护

实验操作时，务必佩戴一次性手套、实验服，必要时佩戴护目镜，以防止试剂污染和交叉感染。

二、标准操作流程

2.1样品制备与反应体系配制

在冰上进行PCR反应体系的配制。严格按照实验设计的比例，依次加入各组分（通常为：水、缓冲液、dNTPs、引物、模板DNA、DNA聚合酶）。每加完一种试剂，应轻微涡旋混匀，并短暂离心以避免气泡产生及试剂挂壁。配制完成后，将反应液小心转移至PCR管或96孔板的相应孔中，注意避免产生气泡。若使用96孔板，加样完成后需使用适配的光学封板膜密封，确保密封紧密，防止蒸发和交叉污染；若为单管，则旋紧管盖。

2.2反应板/管的准备与装载

将密封好的PCR板或装有反应液的PCR管进行短暂离心（低速离心即可，主要目的是去除管盖或封板膜下的气泡，并使反应液集中于管底或孔底）。打开VeritiPCR仪的热盖，小心将PCR板或管放入样品槽内，确保其放置平稳、位置正确，PCR管需完全卡入管座。对于96孔板，请注意板的方向性，通常板上会有定位标记（如缺角或数字指示），应与仪器样品槽上的标记相对应。

2.3热盖设置与关闭

根据所使用的PCR管或板类型，选择合适的热盖高度或压力。Veriti仪器通常提供针对不同耗材的热盖设置选项。确认无误后，轻轻关闭热盖，并旋紧两侧的旋钮（或按动相应的锁定装置），确保热盖与PCR管/板紧密接触，但注意不要过度用力，以免损坏热盖或样品容器。

2.4开机与初始化

按下仪器正面的电源开关，仪器将进行自检和初始化程序。此时屏幕会显示启动信息，待初始化完成后，进入主操作界面。

2.5PCR程序设置

在主界面上，通过仪器面板上的导航键或触摸屏（如配备）进行操作，创建新的PCR程序或调用已保存的程序。

*步骤设置：通常包括预变性、变性、退火、延伸等步骤。

*预变性：一般设置较高温度（如95℃）和较长时间（如2-5分钟），用于DNA模板的完全变性及热启动酶的激活。

*变性：典型温度为94-98℃，时间通常为15-60秒，使双链DNA解链。

*退火：温度根据引物的Tm值确定，通常比Tm值低5℃左右，时间为15-60秒，使引物与模板结合。此步骤若需使用梯度功能，请参见2.6节。

*延伸：温度通常为72℃（Taq酶最适温度），时间根据扩增片段长度和聚合酶效率确定，一般为每千碱基对延伸30-60秒。

*循环数：根据模板浓度和扩增效率设置，通常为25-40个循环。

*最终延伸：可选步骤，一般在72℃延伸5-10分钟，使产物充分延伸。

*保温：反应结束后，通常设置4-16℃进行样品保存。

*温度与时间设定：为每个步骤设定精确的温度和持续时间。

2.6梯度程序设置（如需要）

VeritiPCR仪的核心优势在于其梯度功能，可在同一实验中对不同列的样品进行不同退火温度的筛选。

*在设置退火步骤时，选择“Gradient”选项。

*指定梯度的“目标温度”（通常为中间列的温度）和“梯度范围”（即最高温度与最低温度之间的差值，仪器有最大梯度范围限制，如12℃或16℃）。仪器会自动在样品槽的不同列之间形成一个线性的温度梯度。

*确认梯度设置无误，包括哪一列对应最高温度，哪一列对应最低温度，以便后续结果分析时对应。

2.7程序保存与调用

新程序设置完成后，可将其命名并保存至仪器内存中，以便日后直接调用。保存时建议使用清晰、规范的命名方式，包含关键信息如引物名称、产物片段等。

2.8启动PCR运行

所