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双T-DNA共转化技术在转基因番木瓜培育中的应用与探索

一、引言

1.1研究背景与意义

番木瓜（CaricapapayaL.）作为热带、亚热带地区广泛种植的水果，在全球水果产业中占据重要地位。它不仅口感独特，还富含多种维生素（如维生素C、维生素A等）、矿物质（钾、镁等）和类胡萝卜素等营养成分，具有较高的食用和药用价值，深受消费者青睐。目前，全球番木瓜的种植面积不断扩大，亚洲和拉美地区是主要的生产和消费区域，其中印度、巴西、墨西哥等国家是番木瓜的主要生产国。在中国，番木瓜主要种植于海南、广东、广西、云南等南方省份，成为当地重要的经济作物之一。

然而，番木瓜产业的发展面临诸多挑战，其中番木瓜环斑病毒（Papayaringspotvirus，PRSV）是最为严重的威胁。PRSV属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属，主要通过机械损伤和蚜虫传播，具有发病率高、传播速度快、危害严重的特点，可导致番木瓜叶片出现花叶症状，茎及叶柄形成浸渍状条纹，果实产生环斑，严重时致使植株死亡，造成大面积减产甚至绝收。20世纪90年代，PRSV在夏威夷爆发，短短两年内使Puna地区的番木瓜几乎绝产，并迅速蔓延至全球数十个国家和地区，在我国华南地区也大规模流行，给番木瓜产业带来了沉重打击。

转基因技术的出现为解决番木瓜环斑病毒问题提供了有效途径。通过将外源抗病基因导入番木瓜基因组，可使其获得对PRSV的抗性，从而提高产量和品质。自1986年第一株转烟草花叶病毒TMV外壳蛋白基因的烟草问世，为番木瓜育种带来了新的思路。1990年Fitch等首次建立以胚性愈伤组织为受体的共培养转化体系，获得首例转PRSV外壳蛋白基因番木瓜；1998年转基因番木瓜彩虹“Rainbrow”和日升“Sun-Up”在夏威夷商业化种植，成功挽救了夏威夷番木瓜产业。随后，我国在转基因番木瓜研究方面也取得了显著成果，如“华农1号”等转基因番木瓜品系的培育。

尽管转基因技术在番木瓜育种中取得了成功应用，但转基因生物的安全性问题一直备受关注。其中，选择标记基因的存在引发了诸多担忧，例如抗生素抗性和除草剂抗性的选择标记基因可能导致临床用抗生素失效、抗除草剂基因流入大自然创造出超级杂草，以及对动物和人类健康产生潜在危害等。因此，如何有效解决转基因番木瓜中的选择标记基因问题，成为推动转基因番木瓜产业可持续发展的关键。

双T-DNA共转化技术作为一种解决选择标记基因问题的有效方法，具有重要的研究价值和应用前景。该技术将选择标记基因和目的基因分别构建在同一质粒中相互独立的T-DNA区内，通过农杆菌介导转化，使T-DNA随机插入受体植物基因组。由于T-DNA插入的随机性，选择标记基因和目的基因可整合到不同染色体上，在后代生殖生长阶段，通过配子体重组，有望获得只含目的基因而不含选择标记基因的转基因植株，从而有效解决转基因生物的安全性问题，为转基因番木瓜的商业化推广和应用奠定坚实基础。本研究旨在通过深入探究双T-DNA共转化技术在番木瓜中的应用，优化转化条件，提高转化效率，为培育安全、高效的转基因番木瓜新品种提供技术支持和理论依据，对于推动番木瓜产业的可持续发展具有重要的现实意义。

1.2国内外研究现状

在转基因番木瓜的研究历程中，国外起步较早且取得了一系列具有里程碑意义的成果。1985年，美国率先致力于开发抗PRSV的转基因番木瓜研究，1989年成功对PRSV毒株HA5-1的CP基因进行克隆和测序，并于1991年获得了抗PRSV毒株HA的转基因番木瓜品系55-1。1992年，转基因品系55-1R0代植株的小型田间试验在瓦胡岛展开，实验数据充分证明了其在田间条件下对PRSV的良好抗性。1998年，转基因番木瓜“彩虹”和“日升”在夏威夷实现商业化种植，这是转基因番木瓜发展史上的重要突破，为全球番木瓜产业应对环斑病毒危机提供了成功范例。此外，美国佛罗里达针对当地优势病毒株系，采用多种方式构建植物表达载体，获得高抗植株用于生产；夏威夷转基因番木瓜利用特定病毒株的外壳蛋白基因，通过基因枪技术获得转基因阳性株系并形成商业化品种，其商业化种植经过了严格的环境、食品安全等多方面评估。

我国在转基因番木瓜研究方面也成绩斐然。华南农业大学科研人员在国内率先开展抗PRSV转基因番木瓜的基因工程研究，将我国华南地区PRSV的优势株系YS的复制酶基因转化入番木瓜植株，成功获得高抗的转基因品系——“华农1号”，并于2006年获得在广东省应用的安全证书，在广东大规模种植后，产生了极大的经济、社会和环境效益，从根本上解决了番木瓜生产受PRSV威胁的问题。20