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标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量

标准曲线

一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。

蛋白质含量测定方法

凯氏定氮法

双缩脲法

Folin-酚试剂法

紫外吸收法

考马斯亮蓝法

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作

（一）、试剂：

考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G—250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。

标准蛋白质溶液：

纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

（二）、器材：

1、722S型分光光度计使用及原理（）。

2、移液管使用（）。

（三）、标准曲线制作：

试管编号

0

1

2

3

4

5

6

100ug/ml标准蛋白（ml）

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.15mol/LNaCl（ml）

1

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

考马斯亮蓝试剂（ml）

5

5

5

5

5

5

5

摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色

A595nm

1、

2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20ug、30ug、40ug、50ug、60ug），在坐标轴上绘制标准曲线。

1）、利用标准曲线查出回归方程。

2）、用公式计算回归方程。

3）、或用origin作图，测出回归线性方程。即A595nm=a×X()+6

一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。

4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。

（四）、蛋白质含量的测定：

样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。

（五）、注意事项：

玻璃仪器要洗涤干净。

取量要准确。

玻璃仪器要干燥，避免温度变化。

对照：用被测物质以外的物质作空白对照。

二、磷酸缓冲液的配制。

（一）、配制0.2mol/L即0.2MpH=6.8的磷酸缓冲液。用磷酸氢二钠—磷酸二氢钠做缓冲液。

选用药品：Na2HPO4·12H2O（碱）和NaH2PO4·12H2O（酸）配缓冲液100ml。书中说明。

（二）、计算：

注：书中有注明配置的量。

计算：Na2HPO4·12H2O称取71.64×0.1=7.164g

NaH2PO4·12H2O称取31.21×0.1=3.121g

含有不同结晶水的换算。

书中配1/15mol/L的缓冲液配1L，书中用Na2HPO4·2H2O需要11.87g/L但用Na2HPO4·12H2O需多少g？

11.87=（178/358）×X，X=23.87g。

（三）、分别配制缓冲液各100ml（根据需要确定配制的量）。

即：0.2MNa2HPO4·2H2O和NaH2PO4·2H2O100ml。

（四）、按书中的量配制取量再混合。

如：pH=6.8，分别去缓冲对49ml和51ml。

（五）、用pH试纸ceni索赔的缓冲液的pH值，检测配置是否准确。

（六）如配50mMpH=6.8的缓冲液100ml，以你配制的母液稀释即可。

计算：50×0.1=0.2×1000×X（L）；X=0.025L；

取0.2MpH=7.2的缓冲液25ml，用蒸馏水定容至100ml即可。