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家蚕let-7miRNA靶基因克隆及激素诱导调控机制研究

一、引言

1.1研究背景与意义

家蚕（Bombyxmori）作为一种重要的经济昆虫，在人类历史上占据着独特而关键的地位。其起源于中国，历经5000余年的家养驯化，不仅成为支撑蚕丝产业的生物基础，更是鳞翅目昆虫研究的典型模式生物。家蚕全身都是宝，蚕蛹富含蛋白质、脂肪等营养成分，可作为营养品食用，还能制造成天然氨基酸用于食品及药品生产；雄蚕蛾可制成药酒及滋补品；蚕沙是良好的家畜、鱼类饲料和肥料；蚕丝更是可做成各种精美服饰，蚕茧可作为保鲜剂，丝蛋白可制作膜、微粒子、多孔体等各种材料。从古代丝绸之路开始，家蚕所产蚕丝就成为连接东西方贸易与文化交流的重要纽带，对全球经济和文化发展产生了深远影响。如今，养蚕业依旧是中国农业经济中的重要组成部分，年出口创汇额在农业相关产品中位居前列。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类内生的、长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，广泛存在于动植物中。它们通过与靶mRNA的互补配对，在转录后水平上对基因表达进行调控，参与生物体的各种生理和病理过程。let-7miRNA作为最早被发现的miRNA之一，在进化上高度保守，从秀丽隐杆线虫到人类等众多物种中都有其踪迹，且在发育调控方面发挥着核心作用。在昆虫中，let-7miRNA参与调控生长发育、变态发育、生殖等关键生理过程。例如在果蝇中，let-7miRNA对于幼虫向成虫的转变过程至关重要，其表达水平的变化会直接影响发育进程和成虫形态。

对于家蚕而言，深入探究let-7miRNA的靶基因克隆和激素诱导机制具有多方面的重要意义。从基础研究角度，家蚕作为完全变态昆虫，一生经历卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段，各阶段的时序发育机制尚不完全清楚。明确let-7miRNA的靶基因及其在激素诱导下的调控网络，有助于揭示家蚕发育的分子调控机制，丰富昆虫发育生物学理论。在应用研究方面，家蚕的生长发育和蚕丝产量、质量密切相关。通过解析let-7miRNA的调控机制，有望为家蚕分子育种提供新的靶点和策略，培育出具有优良性状的家蚕品种，从而推动蚕丝产业的升级和发展。此外，家蚕作为鳞翅目害虫研究的典型模式生物，相关研究成果也能为鳞翅目害虫的防治提供理论依据和新思路，有助于开发更环保、高效的害虫防治方法，减少农业和林业因害虫侵害造成的损失。

1.2家蚕let-7miRNA研究现状

目前，关于家蚕let-7miRNA的研究已取得了一系列成果。在表达模式方面，研究发现let-7在家蚕末龄幼虫期开始时在心侧体-咽侧体复合物（CC-CA）中表达明显增加，并在该龄期维持较高水平。在生物学功能探究上，通过构建let-7敲除系和UAS-let-7转基因系，明确了let-7对家蚕变态发育的关键作用。let-7基因敲除的幼虫在预蛹阶段发育停滞，皮层溶离后成为蛹-成虫的中间体；而当let-7在Actin3-GAL4驱动的转录控制下过表达时，幼虫在倒数第二龄（L4）阶段的发育时间和生长受到严重影响，出现早熟变态现象。

在调控机制研究中，已有研究表明蜕皮激素和保幼激素（JHs）的生物合成受到let-7敲除和过量表达的影响，说明let-7参与了家蚕体内激素平衡的调控，是协调蜕皮激素和JHs生物合成以确保家蚕变态过程中发育过渡的关键因子。还有研究通过对let-7敲低品系家蚕幼虫与丝腺进行转录组测序，发现let-7采用不同方式调控家蚕幼虫个体与丝腺的生长。在幼虫其它组织中，let-7敲低促进细胞增殖，使幼虫个体变大；在丝腺不同区段中，let-7敲低则通过刺激丝腺细胞核内复制增加，促进丝腺细胞变大和丝蛋白合成。并预测到细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1是let-7的潜在靶基因，通过体外双荧光素酶及靶位点突变实验证明BmCDK1是let-7的直接靶点，其3′UTR上有且只有一个let-7结合位点。

然而，现有研究仍存在不足与空白。虽然已鉴定出部分let-7的潜在靶基因，但仍有大量靶基因未被发现和验证，这些未知靶基因在let-7调控网络中的作用亟待明确。对于let-7在激素诱导下的具体信号转导通路，目前的了解还不够深入，激素如何通过let-7miRNA调控家蚕的生长发育、生理代谢等过程，仍存在许多待解之谜。不同组织和发育阶段中，let-7miRNA表达的精细调控机制也尚未完全阐明。填补这些研究空白，对于全面理解家蚕let-7miRNA的功能和调控