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临床常用免疫学检测技术演讲人：日期:

目录CATALOGUE02分子免疫学技术03细胞免疫学分析04临床应用场景05新兴检测技术06质量控制与标准化01血清学检测方法

01血清学检测方法PART

ELISA原理与应用双抗体夹心法适用于检测大分子抗原，先将捕获抗体包被于固相载体，加入待测样本后，抗原与抗体结合，再加入酶标记的检测抗体形成“夹心”复合物，最终通过底物显色定量抗原浓度。常用于病毒抗原（如HBsAg）、细胞因子（如IL-6）的检测。间接法竞争法主要用于抗体检测，如HIV抗体筛查。将已知抗原包被于固相载体，加入待测血清后，若含特异性抗体则与之结合，再加入酶标记的二抗（如抗人IgG）显色，通过吸光度值判断抗体水平。适用于小分子抗原（如药物、激素）检测。待测样本与酶标记抗原竞争结合固相抗体，显色强度与样本中抗原浓度呈负相关，常用于甲状腺素（T4）、地高辛等药物浓度监测。123

免疫荧光技术直接免疫荧光法将荧光素标记的特异性抗体直接与组织或细胞中抗原结合，通过荧光显微镜观察定位抗原分布。常用于自身免疫病（如抗核抗体检测）和病原体鉴定（如呼吸道合胞病毒）。时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）采用镧系元素（如铕）作为荧光标记物，利用其长荧光寿命特性延迟检测，有效消除背景荧光干扰，用于超敏标志物如肿瘤标志物AFP、CEA的定量分析。间接免疫荧光法先以未标记的一抗与抗原结合，再用荧光标记的二抗识别一抗，放大信号并提高灵敏度。广泛应用于抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）和抗线粒体抗体（AMA）检测。

颗粒性抗原（如细菌、红细胞）直接与相应抗体结合形成肉眼可见的凝集块。例如伤寒沙门菌O抗原的肥达试验、ABO血型鉴定中的玻片凝集法。凝集试验类型直接凝集试验将可溶性抗原吸附于载体颗粒（如乳胶、红细胞）表面，再与抗体反应产生凝集。如类风湿因子（RF）检测采用IgG包被乳胶颗粒，抗HCV抗体检测常用红细胞作为载体。间接凝集试验检测不完全抗体，通过加入抗人球蛋白抗体桥联已结合红细胞的IgG抗体，促发凝集反应。分为直接法（检测红细胞表面抗体，如新生儿溶血病）和间接法（检测血清中游离抗体，如输血前交叉配血）。抗球蛋白试验（Coombs试验）

02分子免疫学技术PART

Westernblot操作流程样品制备与蛋白提取需使用裂解液（如RIPA缓冲液）破碎细胞或组织，离心后获取上清液，并通过BCA或Bradford法测定蛋白浓度，确保后续电泳上样量一致。SDS电泳分离根据目标蛋白分子量选择合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶，将蛋白样品与上样缓冲液混合并煮沸变性后上样，在恒定电压下进行电泳分离，使蛋白按分子量大小分离成条带。转膜与封闭采用湿转或半干转法将凝胶中的蛋白转移至PVDF或NC膜上，转膜后需用5%脱脂牛奶或BSA溶液封闭1小时，以减少非特异性结合。抗体孵育与显影先后加入一抗（特异性识别目标蛋白）和二抗（HRP或荧光标记），经TBST洗涤后，通过ECL化学发光或荧光成像系统检测信号，分析目标蛋白表达水平。

流式细胞术分析样本制备与染色将细胞悬液用胰酶消化或机械分散后，经PBS洗涤，采用荧光标记抗体（如FITC、PE、APC等）对表面或胞内靶标进行特异性染色，避光孵育后离心去除未结合抗体。流式细胞仪校准使用标准微球（如CaliBRITEbeads）校准仪器光学系统和流体系统，确保激光功率、PMT电压及补偿参数准确，避免多色检测时的荧光溢漏。数据采集与分析细胞悬液通过流式细胞仪喷嘴形成单细胞流，激光激发荧光信号并被检测器捕获，利用FlowJo或FCSExpress软件设门分析特定细胞亚群（如CD4+T细胞）的比例及平均荧光强度（MFI）。多参数与功能检测可结合胞内细胞因子染色（ICS）、增殖染料（CFSE）或凋亡标记（AnnexinV/PI），实现细胞功能、周期及死亡状态的同步分析。

PCR相关检测从血液、组织或细胞中提取基因组DNA或RNA（后者需逆转录为cDNA），通过Nanodrop测定纯度（A260/A280比值1.8-2.0）及浓度，确保模板质量符合扩增要求。模板DNA制备针对靶基因设计特异性引物（长度18-22bp，Tm值55-65℃），配置含TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2及缓冲液的PCR体系，通过梯度PCR确定最佳退火温度。引物设计与反应体系优化典型程序包括预变性（95℃5min）、35-40个循环的变性（95℃30s）-退火（Tm-5℃30s）-延伸（72℃1min/kb），最后72℃终延伸10分钟，确保产物完整性。扩增程序设置通过琼脂糖凝胶电泳验证扩增片段大小，或采用实时荧光定量PCR（qPCR）结合SYBRGreen或TaqMan探针进行绝对定量，应用于基因表达分析、病原体检测或突变筛查。产物分析与应用

03细胞免疫