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细胞房使用流程及细胞培养注意事项流程汇报人：XXX2025-X-X

目录1.细胞房使用流程

2.细胞培养基本操作

3.细胞冻存与复苏

4.细胞培养液的选择与配制

5.细胞培养中的常见问题及解决方法

6.细胞培养设备的维护与保养

7.细胞培养的安全规范

8.细胞培养的记录与报告

01细胞房使用流程

进入细胞房前的准备个人卫生与着装工作人员进入细胞房前需更换专用工作服，头发需束起，佩戴帽子和口罩，确保个人卫生。进入前应洗手并消毒，避免携带外来污染物。实验物品准备检查实验所需物品是否齐全，包括细胞、培养基、试剂、器皿等，确保实验所需材料符合要求。实验前对设备进行校准和检查，保证设备正常运行。环境与消毒确认细胞房环境整洁，温湿度适宜，无异味。使用消毒剂对实验区域进行彻底消毒，包括工作台、仪器设备等，消毒时间不少于30分钟。

进入细胞房的操作规范进入步骤首先更换无菌工作服，通过消毒通道，确保鞋底消毒彻底。进入前需佩戴防护口罩和帽子，避免携带细菌和尘埃。进入后不得随意触摸墙壁和其他物品。操作规范进行操作时，应遵循无菌操作原则，避免交叉污染。所有操作应在超净工作台内完成，避免直接接触实验物品。操作过程中，动作需轻柔，避免产生气流扰动细胞。退出程序实验结束后，将使用过的物品进行分类处理，实验器材需清洗消毒。在细胞房内不得携带任何食物，离开时需再次消毒双手，确保不带出任何污染物。

细胞房内基本操作步骤细胞接种根据实验需求，计算接种密度，将细胞悬液缓慢加入培养瓶中，轻轻摇匀，确保细胞均匀分布。接种后需将培养瓶放置于适宜温度和二氧化碳浓度的培养箱中。细胞传代当细胞长满培养瓶底部时，进行细胞传代。先用PBS洗涤细胞，去除代谢产物，然后用酶消化细胞，最后将细胞重新接种到新的培养瓶中。传代频率一般为2-3天一次。细胞冻存在细胞生长稳定时，进行细胞冻存。将细胞悬液分装至冻存管中，加入保护剂，迅速降至-80℃冰箱，最后转入液氮罐中保存。冻存前需确保细胞活力在95%以上。

02细胞培养基本操作

细胞培养器皿的准备与消毒器皿清洗实验前需将所有器皿彻底清洗干净，使用去污剂去除油污，再用双蒸水冲洗。清洗后应晾干或烘干，确保无水迹残留。清洗步骤需重复3-5次以确保清洁度。器皿消毒清洗干净的器皿需进行高压蒸汽灭菌或使用化学消毒剂进行消毒。高压蒸汽灭菌需在121℃下保持15-20分钟，化学消毒剂如75%酒精浸泡30分钟或2%戊二醛溶液浸泡1小时。干燥储存消毒后的器皿应在超净工作台内晾干或使用无菌吹风机吹干，然后储存于无菌柜中。储存前需检查器皿有无破损或污染，确保无菌状态。储存时间不宜过长，一般不超过一周。

细胞接种与传代操作接种操作细胞接种时，将细胞悬液以1:10的比例接种到培养瓶中，轻轻摇匀。接种后置于培养箱中，细胞在24小时内应开始生长。接种过程中避免气泡产生，以免影响细胞生长。传代时间细胞传代一般在细胞长满培养瓶底部的70-80%时进行。传代频率通常为2-3天一次，以确保细胞活力和生长状态。传代操作需在细胞活力超过95%时进行。消化处理传代前需用0.25%胰蛋白酶或0.05%EDTA消化细胞，消化时间约2-3分钟。消化过程中需轻轻摇动培养瓶，避免细胞团块形成。消化结束后，迅速加入等量的培养基终止消化。

细胞培养环境的控制温度控制细胞培养温度需恒定在37±0.5℃，使用培养箱进行精确控制。温度波动过大可能影响细胞生长和代谢。定期检查培养箱的温度设置和运行状态。pH调节细胞培养液的pH值应维持在7.2-7.4之间，使用CO2培养箱或pH缓冲液进行调节。pH值的微小变化也会影响细胞的生长和功能。二氧化碳浓度培养箱中的二氧化碳浓度应维持在5-7%，以提供细胞所需的二氧化碳和氧气平衡。CO2浓度过高或过低都会影响细胞生长和实验结果。

03细胞冻存与复苏

细胞冻存前准备细胞活力检测冻存前需检测细胞活力，确保活力在95%以上。活力过低会影响复苏后的细胞生长和实验结果。常用方法包括台盼蓝染色和MTT法等。细胞悬液制备将细胞洗涤两次，去除培养基中的杂质，然后加入冻存保护剂（如DMSO或甘油）和缓冲液，调整细胞浓度至1×10^6个细胞/毫升。冻存管准备使用无菌冻存管，分装细胞悬液，每管约1毫升。标记管子，记录细胞种类、浓度、冻存日期等信息。确保冻存管密封良好，避免泄漏。

细胞冻存操作步骤快速冷却将装有细胞悬液的冻存管放入液氮蒸汽中快速冷却，时间约10分钟。避免直接将冻存管浸入液氮中，以防玻璃破裂。转移液氮将快速冷却后的冻存管转移到液氮中，确保细胞悬液完全被液氮覆盖。在液氮中储存至少2小时，直至细胞完全冷冻。长期储存长期储存时，将冻存管放置于-80℃冰箱中。如需长期保存，可转移至-196℃的液氮罐中，确保细胞在极端低温下稳定保存，避免反复冻融。

细胞复苏操作步骤缓慢复