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副猪嗜血杆菌dsbA基因缺失株的构建及功能研究

一、研究背景

副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis，HPS）是一种革兰氏阴性短小杆菌，是猪格拉瑟氏病（Gl?ssersdisease）的病原菌。该菌主要感染仔猪和青年猪，可引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。

dsbA基因编码的二硫键氧化还原酶（DsbA）在许多革兰氏阴性菌中起着重要作用，它参与细菌外膜蛋白、分泌蛋白等的二硫键形成，对这些蛋白的正确折叠和功能发挥至关重要，进而影响细菌的毒力、黏附、侵袭等生物学特性。然而，关于副猪嗜血杆菌中dsbA基因的功能研究尚处于起步阶段，构建该基因的缺失株并深入探究其功能，对于揭示副猪嗜血杆菌的致病机制以及开发有效的防控措施具有重要意义。

二、副猪嗜血杆菌dsbA基因缺失株的构建

（一）实验材料

菌株与质粒：副猪嗜血杆菌野生株（本实验室保存）、大肠杆菌DH5α（用于质粒构建）、自杀性质粒pEMOC2（携带氯霉素抗性基因）。

酶与试剂：限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶、质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒等。

引物：根据副猪嗜血杆菌dsbA基因序列及自杀性质粒pEMOC2的序列，设计用于扩增dsbA基因上下游同源臂及筛选的引物。

（二）构建方法

扩增dsbA基因上下游同源臂：以副猪嗜血杆菌野生株的基因组DNA为模板，利用设计好的引物分别扩增dsbA基因的上游同源臂（UP）和下游同源臂（DOWN）。

构建重组自杀质粒：将上游同源臂和下游同源臂通过重叠延伸PCR连接起来，形成UP-DOWN片段。用限制性内切酶分别切割UP-DOWN片段和自杀性质粒pEMOC2，然后通过T4DNA连接酶将两者连接，构建重组自杀质粒pEMOC2-ΔdsbA。

转化与筛选：将重组自杀质粒通过电转化的方法导入副猪嗜血杆菌野生株中，利用氯霉素抗性进行筛选。通过PCR和测序验证，获得dsbA基因缺失株（ΔdsbA）。

三、副猪嗜血杆菌dsbA基因缺失株的功能研究

（一）生长特性研究

将副猪嗜血杆菌野生株和ΔdsbA缺失株分别接种于TSA培养基中，在37℃、5%CO?培养条件下，每隔一定时间测定菌液的OD???值，绘制生长曲线。结果显示，ΔdsbA缺失株的生长速率较野生株有所降低，表明dsbA基因对副猪嗜血杆菌的生长有一定的影响。

（二）毒力相关表型研究

黏附与侵袭能力测定：采用猪血管内皮细胞（PVEC）进行黏附与侵袭实验。将野生株和ΔdsbA缺失株分别与PVEC共孵育，计算黏附率和侵袭率。结果发现，ΔdsbA缺失株对PVEC的黏附率和侵袭率显著低于野生株，说明dsbA基因参与了副猪嗜血杆菌对宿主细胞的黏附和侵袭过程。

生物膜形成能力测定：采用结晶紫染色法测定野生株和ΔdsbA缺失株的生物膜形成能力。结果显示，ΔdsbA缺失株形成的生物膜量明显少于野生株，表明dsbA基因对副猪嗜血杆菌生物膜的形成具有重要作用。

（三）应激耐受性研究

氧化应激耐受性：将野生株和ΔdsbA缺失株分别暴露于不同浓度的H?O?中，测定其存活率。结果表明，ΔdsbA缺失株在H?O?处理后的存活率显著低于野生株，说明dsbA基因能提高副猪嗜血杆菌对氧化应激的耐受性。

渗透压应激耐受性：将野生株和ΔdsbA缺失株分别接种于不同渗透压的TSB培养基中，测定其生长情况。结果显示，在高渗透压条件下，ΔdsbA缺失株的生长受到明显抑制，而野生株的生长相对较好，表明dsbA基因有助于副猪嗜血杆菌应对渗透压应激。

四、结论与展望

（一）结论

本研究成功构建了副猪嗜血杆菌dsbA基因缺失株（ΔdsbA）。功能研究表明，dsbA基因对副猪嗜血杆菌的生长、黏附与侵袭、生物膜形成以及应激耐受性等方面均具有重要影响，提示该基因可能在副猪嗜血杆菌的致病过程中发挥着关键作用。

（二）展望

本研究为深入理解副猪嗜血杆菌的致病机制提供了重要的实验依据。未来可以进一步研究dsbA基因调控副猪嗜血杆菌上述生物学特性的分子机制，探索其与其他基因的相互作用。同时，ΔdsbA缺失株有望作为候选疫苗株进行研究，为开发副猪嗜血杆菌病的有效防控措施奠定基础。