DB51_T 2906-2022 猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范.docxVIP

ICS11.220CCSB41

DB51

四川省地方标准

DB51/T2906—2022

猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范

Technicalspecificationforisolationandidentificationofswinegaetavirus

2022-05-20发布2022-07-01实施

四川省市场监督管理局发布

I

DB51/T2906—2022

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4缩略语 1

5试剂与设备 1

5.1主要试剂 1

5.2主要仪器设备 2

6样品的采集、保存与运输 2

6.1猪只临床发病特征 2

6.2临床样品的采集 2

6.3保存与运输 2

7病毒的细胞分离培养 2

7.1生物安全措施 2

7.2样品的处理 2

7.3单层细胞制备 2

7.4接种细胞 2

7.5病毒收获 3

8病毒核酸RT-PCR鉴定 3

8.1核酸提取和反转录 3

8.2RT-PCR扩增 3

9结果判定 4

9.1RT-PCR 4

9.2病毒分离鉴定 4

附录A（规范性）试剂配制 5

附录B（资料性）猪源盖塔病毒CAP基因扩增序列 6

DB51/T2906—2022

II

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。

本文件主要起草单位：四川省动物疫病预防控制中心、四川农业大学。

本文件主要起草人：陈斌、朱玲、钟攀、陈弟诗、周明忠、徐志文、邓飞、邵靓、李丽、周莉媛、张睿、谢嘉宾、王英、文豪、徐凯、黄先奇、陈亮、张国华、李莎莎、吉色曲伍、孙贤刚、江朝源。

本文件首次发布。

DB51/T2906—2022

1

猪盖塔病毒分离与鉴定技术规范

1范围

本文件规定了猪源盖塔病毒分离与鉴定方法。

本文件适用于猪及其产品中盖塔病毒病原分离和鉴定、实验室诊断、监测和流行病学调查。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样本采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BHK-21：乳仓鼠肾源细胞

CPE：细胞病变

DMEM：细胞营养液

DNAmarker：DNA相对分子质量标记

FBS：胎牛血清

GETV：盖塔病毒

HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸

PBS：磷酸缓冲液

RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应

5试剂与设备

5.1主要试剂

5.1.1所用生化试剂均为分析纯。

5.1.2实验用水应符合GB/T6682一级水要求或采用超纯水，并经高温灭菌。

5.1.3BHK-21、DMEM培养基、FBS、HEPES缓冲液(1mol/L储存液)、0.01mol/LpH7.0~7.4PBS(参见附录A)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR反应混合液（2×)。

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2

5.2主要仪器设备

微量可调移液器、二氧化碳恒温箱、组织破碎仪、高速离心机、PCR仪、稳压稳流电泳仪和水平电泳槽、凝胶成像仪、倒置生物显微镜。

6样品的采集、保存与运输

6.1猪只临床发病特征

新生仔猪出现腹泻、厌食、皮肤红变、舌颤、肢体不协调，10日龄以上小猪出现精神颓废、发热、食欲减退、日增重显著下降和妊娠母猪出现繁殖障碍综合征等临床症状时，均可认为疑似猪盖塔病毒感染。

6.2临床样品的采集

采取疑似猪盖塔病毒感染的淋巴结、胎盘、羊水、死胎、肺、肝、肾、小脑等靶组织约2g~5g或血液样品1mL~2mL，组织装入无菌自封样品袋或离心管，血液装入抗凝血管中待检。

6.3保存与运输

采集的样品应按照NY/T541（所有部分）要求包装和运输，尽快运送到实验室。样品在2℃~