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转双基因（pGH+IGF-I）猪的制备及多维度检测技术探究

一、引言

1.1研究背景与意义

随着人口的增长和生活水平的提高，对肉类的需求持续攀升，畜牧业面临着提高生产效率和产品质量的巨大挑战。转基因技术作为现代生物技术的重要组成部分，为畜牧业的发展开辟了新的道路。通过将外源基因导入动物基因组，能够实现对动物生长、发育、抗病等性状的精准调控，从而培育出具有优良性能的家畜品种。

猪作为全球最重要的肉类来源之一，其育种工作一直备受关注。生长激素（pGH）和胰岛素样生长因子-I（IGF-I）在猪的生长发育过程中扮演着关键角色。pGH由猪垂体前叶分泌，是一种单链多肽类激素，能够刺激动物的饮食摄入，促进蛋白质合成和累积，进而提高肉和脂肪的沉积速度。IGF-I则是pGH的最重要下游效应物，主要由肝脏合成，它可以直接影响生长激素的生物效应，在细胞的增殖、分化和凋亡等过程中发挥着重要作用。

将pGH和IGF-I基因导入猪的基因组中，有望显著提高猪的生长速度、饲料转化率和瘦肉率，降低养殖成本，满足市场对高品质猪肉的需求。同时，这也有助于推动我国养猪业的现代化转型，提高我国在国际畜牧领域的竞争力。因此，开展转双基因（pGH+IGF-I）猪的制备及检测研究具有重要的理论意义和实际应用价值。

1.2国内外研究现状

自转基因技术诞生以来，国内外科研人员在转双基因猪的制备和检测方面开展了大量研究，并取得了一系列重要成果。

在转基因猪的制备技术方面，早期主要采用显微注射法。1985年，Hammer等首次将人的生长激素基因导入猪受精卵中，获得1头转基因猪，与同窝非转基因猪比较，生长速度显著提高，开启了转基因猪研究的先河。随后，Pursel等把牛的生长激素基因转入猪体内，获得2个猪的家系，生长速度提高11%-14%，饲料转化率提高16%-18%。我国科学家也积极开展相关研究，将猪GH基因转入湖北白猪受精卵中，获得首批转基因猪，经几个子代的观察，生长速度和饲料利用率分别比同窝猪提高13.4%和10%。然而，显微注射法存在操作复杂、效率低下、对胚胎损伤大等缺点。

为了克服这些问题，近年来发展了多种新的转基因技术，如精子载体法、慢病毒介导法、体细胞核移植法等。精子载体法是利用精子具有携带外源DNA的能力，将外源基因导入受精卵，具有操作简单、成本低等优点。姚延珠等采用精子载体法，将构建的pcDNA3.1(+)-pGH-IGF-I双基因共表达载体用纳米材料包裹后转染长白猪精子，成功制备转双基因猪，转双基因阳性率为30.76%。慢病毒介导法能够高效地将外源基因整合到宿主基因组中，且整合位点相对随机，可实现稳定表达。体细胞核移植法则是将转基因体细胞的细胞核移植到去核卵母细胞中，再将重组胚胎移植到代孕母猪体内，从而获得转基因猪。该方法可以在细胞水平对转基因进行筛选和鉴定，提高转基因效率和准确性。

在转基因猪的检测技术方面，目前常用的方法包括PCR技术、Southernblotting技术、荧光定量PCR技术、Westernblotting技术等。PCR技术具有快速、灵敏、特异性强等优点，可用于转基因猪外源基因的初步检测。通过设计特异性引物，扩增外源基因片段，从而判断转基因猪是否阳性。Southernblotting技术则可以进一步确定外源基因在基因组中的整合情况，如整合位点、拷贝数等。荧光定量PCR技术能够对转基因猪体内外源基因的表达水平进行定量分析，为研究基因功能和调控机制提供重要数据。Westernblotting技术则用于检测转基因猪体内目的蛋白的表达情况，从蛋白质水平验证转基因的效果。

尽管国内外在转双基因猪的制备和检测方面取得了一定进展，但仍存在一些不足之处。例如，转基因效率较低，导致制备转基因猪的成本较高、周期较长；外源基因的整合和表达不稳定，可能会出现基因沉默、表达水平不一致等问题，影响转基因猪的性能和稳定性；对转基因猪的安全性评估还不够完善，包括对环境和人类健康的潜在风险等方面，需要进一步深入研究。

1.3研究目标与内容

本研究旨在通过基因工程技术，成功制备转双基因（pGH+IGF-I）猪，并建立一套有效的检测方法，对转基因猪的基因整合、表达和稳定性进行全面检测和分析。具体研究内容如下：

基因获取与载体构建：从长白猪耳样中提取总RNA，经反转录RT-PCR获得pGH基因不含终止密码子的编码序列和IGF-I基因完整的编码序列。将这两个基因经酶切连接克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体上，构建pcDNA3.1(+)-pGH-IGF-I双基因共表达载体，并对载体进行酶切和测序鉴定，确保载体构建正确。

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