复合成骨诱导剂促进大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的实验研究.docxVIP

复合成骨诱导剂促进大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

一、引言

骨髓基质干细胞（BoneMarrowStromalStemCells，BMSCs）作为一种存在于骨髓基质中的成体干细胞群体，具有多向分化潜能，在骨组织工程领域展现出巨大的应用潜力。在众多诱导BMSCs向成骨细胞分化的研究中，复合成骨诱导剂的应用成为焦点。本研究旨在深入探究复合成骨诱导剂对大鼠BMSCs向成骨细胞分化的促进作用，为骨组织工程的发展提供更坚实的理论基础和实验依据。

二、材料与方法

2.1实验动物及主要试剂与仪器

选取2月龄健康SD雄性大鼠若干只，购自[实验动物供应单位名称]。主要试剂包括L-DMEM培养基（[品牌名称]）、10%胎牛血清（FBS，[品牌名称]）、地塞米松（[品牌名称]）、β-甘油磷酸钠（[品牌名称]）、抗坏血酸（[品牌名称]）、阿仑膦酸钠（[品牌名称]）、BCA蛋白定量试剂盒（[品牌名称]）、Western-blot相关试剂（[品牌名称]）等。主要仪器有高速离心机（[型号及品牌]）、CO?培养箱（[型号及品牌]）、倒置显微镜（[型号及品牌]）、酶标仪（[型号及品牌]）等。

2.2BMSCs的采集、分离及培养

将SD大鼠脱颈椎处死后，迅速取出股骨和胫骨，用含双抗的PBS冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液。采用密度梯度离心法，将骨髓细胞悬液置于淋巴细胞分离液上，以一定转速离心后，吸取中间白膜层细胞，用含10%FBS的L-DMEM培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO?培养箱中培养。24h后首次换液，去除未贴壁细胞，此后每2-3天换液一次，待细胞融合达80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。

2.3大鼠BMSCs的表型鉴定

取生长良好的第3代BMSCs，制成单细胞悬液，分别加入抗大鼠CD105、CD73、CD90、CD34、CD45的荧光标记抗体，4℃避光孵育30min，用流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达情况，以鉴定BMSCs。

2.4大鼠骨髓基质干细胞的生长曲线绘制

取第3代BMSCs，以1×10?个/孔的密度接种于96孔板中，每组设6个复孔。分别在接种后第1、2、3、4、5、6、7天，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续孵育2-4h，用酶标仪在450nm波长处测定各孔吸光度值（OD值），以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

2.5大鼠骨髓基质干细胞的成骨诱导

将第3代BMSCs调整细胞浓度为1×10?/L，分为7组，每组设3个复孔。A组为空白组，在含10%FBS的L-DMEM培养基中培养；B组为常规诱导组，在含10??mol/L地塞米松、10.0mmol/Lβ-甘油磷酸钠和50mg/L抗坏血酸的L-DMEM培养基中培养；C、D、E、F、G组为复合诱导组，在与B组相同浓度的成骨诱导液中分别加入10??mol/L、10??mol/L、10??mol/L、10??mol/L、10?1?mol/L的阿仑膦酸钠。每隔3天换液一次，在倒置显微镜下观察细胞的形态变化。

2.6Western-blot检测BMP-2的表达

诱导培养2周后，收集各组细胞，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜后用5%脱脂奶粉封闭，分别加入兔抗大鼠BMP-2一抗和β-actin一抗，4℃孵育过夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入相应的HRP标记的二抗，室温孵育1-2h，再次用TBST洗膜3次，每次10min。最后用化学发光底物显色，曝光显影，用ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin为内参，计算BMP-2的相对表达量。

三、实验结果

3.1形态学观察

空白组细胞呈长梭形，增殖活跃，形态未见明显变化。常规诱导组细胞体积逐渐增大，部分细胞伸出胞浆突起。复合诱导组中，随着阿仑膦酸钠浓度的变化，细胞形态有所不同。其中E组（10??mol/L阿仑膦酸钠）细胞体积变得肥大，长出多个胞浆突起呈多角形，细胞周围可见云雾状分泌物，与其他组相比，细胞形态变化最为显著。

3.2大鼠BMSCs的表型鉴定结果

流式细胞仪检测结果显示，第3代BMSCs中CD105、CD73、CD90阳性表达率分别为[具体阳性率数值]，而CD34、CD45阳性表达率极低，符合BMSCs的表型特征。

3.3大