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研究报告

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大肠杆菌表面展示lppOmpA-MTs工程菌的构建及对稀土金属钇的吸附

一、1.大肠杆菌表面展示lppOmpA-MTs工程菌的构建

1.1.构建策略选择

在构建大肠杆菌表面展示lppOmpA-MTs工程菌的过程中，构建策略的选择至关重要。首先，考虑到lppOmpA-MTs蛋白在大肠杆菌中的表达水平，我们选取了pET系统作为表达载体，该系统具有高效的蛋白表达能力，能够确保目的蛋白的产量。其次，为了实现lppOmpA-MTs蛋白在大肠杆菌表面的展示，我们采用了融合表达策略，将lppOmpA-MTs蛋白与大肠杆菌的脂多糖（LPS）融合，形成LppOmpA-MTs-LPS融合蛋白。这种融合表达策略能够利用LPS的脂质双层特性，将融合蛋白锚定在大肠杆菌的细胞膜上。此外，我们还考虑了融合蛋白的稳定性问题，因此对融合蛋白的结构进行了优化，通过引入特定的信号肽序列，确保融合蛋白的正确折叠和稳定性。

在构建策略的具体实施上，我们首先对lppOmpA-MTs蛋白的基因序列进行了克隆和优化，以确保基因序列的准确性和表达效率。随后，我们将优化后的基因序列克隆到pET表达载体中，构建了pET-lppOmpA-MTs重组表达质粒。为了提高表达效率，我们在表达载体中引入了强启动子和终止子，同时优化了密码子使用频率，以适应大肠杆菌的表达系统。在构建过程中，我们还对表达载体进行了安全性评估，确保其不含有任何潜在的致病基因。

最后，为了确保构建的工程菌能够成功表达并展示目的蛋白，我们进行了详细的构建策略评估。首先，通过分子生物学技术对重组表达质粒进行了鉴定，包括质粒的提取、PCR扩增、酶切鉴定和测序分析等。其次，对大肠杆菌工程菌的构建过程进行了优化，包括菌株的选择、转化方法、诱导表达条件等。此外，我们还对工程菌的蛋白表达水平、纯化效果和展示效率进行了评估，确保构建的工程菌能够满足后续实验的需求。通过这些构建策略的选择和实施，我们为后续的稀土金属钇吸附实验奠定了坚实的基础。

1.2.表达载体的构建

(1)表达载体的构建是构建大肠杆菌表面展示lppOmpA-MTs工程菌的关键步骤。本研究中，我们选用了pET表达系统作为载体，该系统以其高效的表达能力而著称。通过优化载体中的启动子，我们实现了目的蛋白的稳定和高效表达。例如，在pET系统中，T7启动子被广泛应用于表达真核生物蛋白，其转录效率高，蛋白表达水平可达菌体总蛋白的30%以上。在具体操作中，我们通过PCR扩增获得了lppOmpA-MTs蛋白的基因片段，并将其克隆到pET载体中，构建了pET-lppOmpA-MTs重组表达质粒。

(2)在构建过程中，我们特别关注了载体的稳定性。通过酶切分析，我们确认了质粒的线性化状态，这有助于提高转化效率。此外，我们还对质粒的拷贝数进行了优化，以避免过高的拷贝数导致的蛋白表达水平下降。根据文献报道，pET系统的拷贝数通常在20-30之间，这有助于平衡蛋白表达水平与细胞生长速度。在我们的实验中，通过优化转化条件，我们成功地将质粒导入大肠杆菌中，实现了高拷贝数的稳定表达。

(3)为了验证构建的pET-lppOmpA-MTs重组表达质粒的有效性，我们进行了蛋白表达水平的检测。通过Westernblot分析，我们观察到目的蛋白在诱导表达后，其表达量显著增加，达到了预期水平。此外，我们还对蛋白的纯度进行了评估，结果显示纯化后的蛋白纯度达到了95%以上。这一结果表明，我们构建的pET-lppOmpA-MTs表达载体能够有效地表达目的蛋白，为后续的大肠杆菌表面展示提供了坚实的基础。

1.3.表达载体的筛选与鉴定

(1)表达载体的筛选与鉴定是确保工程菌构建成功的关键环节。在本次研究中，我们首先通过PCR和酶切分析对构建的pET-lppOmpA-MTs重组表达质粒进行了初步鉴定。通过1%琼脂糖凝胶电泳，我们观察到预期大小的目的基因条带，表明目的基因已成功克隆到表达载体中。随后，通过测序验证，测序结果与预期基因序列完全一致，确保了重组质粒的准确性。

(2)为了进一步验证重组质粒在大肠杆菌中的表达，我们选取了DH5α菌株作为转化宿主，并采用热击法进行了质粒转化。转化后的菌液经过涂布在含有卡那霉素的LB平板上，挑选出白色单菌落进行PCR验证。结果显示，转化子菌落均能扩增出目的基因片段，表明pET-lppOmpA-MTs重组质粒已成功转化到大肠杆菌中。进一步通过蛋白表达分析，我们发现转化子菌液的蛋白浓度达到了1mg/mL，远高于未转化菌液的蛋白浓度，这表明重组质粒在大肠杆菌中实现了高效表达。

(3)为了确保表达载体的稳定性，我们对转化子进行了传代培养，连续传代30代后，仍能观察到目的蛋白的表达。通过Westernblot分析，我们发现目的蛋白