黄曲霉毒素m1及其与黄曲霉毒素b1共存时对人肠道上皮细胞caco--2的毒性作用研究.docVIP

黄曲霉毒素m1及其与黄曲霉毒素b1共存时对人肠道上皮细胞caco--2的毒性作用研究

一、研究背景

黄曲霉毒素（Aflatoxins）是一类由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的具有强烈毒性和致癌性的次生代谢产物。其中，黄曲霉毒素B1（AFB1）是最常见且毒性最强的一种，被国际癌症研究机构（IARC）列为1类致癌物。黄曲霉毒素M1（AFM1）是AFB1在动物体内经过羟基化代谢产生的产物，可存在于牛奶及其制品等食物中。

人肠道上皮细胞Caco-2是一种广泛用于研究肠道生理和毒理学的细胞模型，其在体外培养条件下可自发分化形成类似小肠上皮细胞的结构和功能特征。研究AFM1及其与AFB1共存时对Caco-2细胞的毒性作用，有助于深入了解这些毒素对肠道健康的潜在危害机制，为保障食品安全和人体健康提供理论依据。

二、实验方法

1.细胞培养

将Caco-2细胞培养在含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO?的细胞培养箱中，定期换液，待细胞生长至对数生长期时进行实验。

2.毒素处理

-设立不同浓度的AFM1处理组（如0.1、1、10μmol/L等）、AFB1处理组（如0.01、0.1、1μmol/L等）以及AFM1与AFB1不同比例混合的联合处理组（例如AFM11μmol/L+AFB10.1μmol/L等）。同时设置对照组，仅加入等量的DMSO（毒素溶解剂）。

-将不同处理组的毒素加入到培养的Caco-2细胞中，作用一定时间（如24h、48h、72h等）。

3.检测指标及方法

-细胞活力检测：采用MTT法或CCK-8法。在毒素处理相应时间后，向每孔加入一定量的MTT或CCK-8试剂，继续孵育一定时间后，用酶标仪测定吸光度值，计算细胞活力，以反映毒素对细胞增殖的影响。

-细胞凋亡检测：使用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术。收集处理后的细胞，按照试剂盒说明书进行染色，然后通过流式细胞仪检测细胞凋亡率，区分早期凋亡和晚期凋亡细胞。

-氧化应激相关指标检测：检测细胞内活性氧（ROS）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性以及丙二醛（MDA）含量等。ROS水平可通过荧光探针DCFH-DA进行检测，利用荧光显微镜或流式细胞仪观察荧光强度；SOD、GSH-Px活性以及MDA含量则采用相应的试剂盒，按照说明书进行操作并通过酶标仪测定吸光度来计算。

-炎症因子表达检测：通过实时荧光定量PCR检测细胞中炎症因子如白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等的mRNA表达水平，以了解毒素对细胞炎症反应的影响。提取细胞总RNA，反转录为cDNA，然后进行PCR扩增，以β-actin作为内参基因，采用2?ΔΔCt法计算炎症因子mRNA的相对表达量。同时，也可采用ELISA法检测细胞培养上清液中炎症因子的蛋白水平。

三、实验结果

1.细胞活力

AFM1和AFB1单独处理时，随着毒素浓度的增加和处理时间的延长，Caco-2细胞活力逐渐下降，呈剂量-效应和时间-效应关系。在联合处理组中，细胞活力下降更为明显，表明AFM1和AFB1共存时对细胞增殖具有协同抑制作用。

2.细胞凋亡

AFM1和AFB1处理均可诱导Caco-2细胞凋亡，且联合处理组的凋亡率显著高于单独处理组。凋亡相关蛋白如Bax、Caspase-3等的表达上调，而Bcl-2表达下调，进一步证实了毒素诱导的细胞凋亡机制。

3.氧化应激

AFM1和AFB1处理后，细胞内ROS水平显著升高，SOD和GSH-Px活性降低，MDA含量增加。联合处理组的氧化应激损伤更为严重，提示两种毒素共存时加剧了细胞内的氧化还原失衡，导致氧化应激反应增强。

4.炎症反应

实时荧光定量PCR和ELISA结果显示，AFM1和AFB1单独及联合处理均能显著上调Caco-2细胞中IL-6、TNF-α等炎症因子的mRNA和蛋白表达水平，且联合处理组的炎症因子表达量高于单独处理组，表明两种毒素可诱导肠道上皮细胞发生炎症反应，且联合作用时炎症反应更为剧烈。

四、结论

AFM1及其与AFB1共存时对人肠道上皮细胞Caco-2具有明显的毒性作用。它们通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、引发氧化应激反应以及激活炎症信号