基于金纳米颗粒与发夹型核酸探针的DNA甲基化酶电化学检测技术研究.docxVIP

基于金纳米颗粒与发夹型核酸探针的DNA甲基化酶电化学检测技术研究

一、绪论

1.1DNA甲基化概述

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，在不改变DNA序列的前提下，对基因表达进行调控，进而影响生物体的各种生理过程。其过程主要是在DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）的催化作用下，将甲基从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移至DNA特定碱基上，形成甲基化修饰的DNA。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶5碳位，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC），这是目前发现的哺乳动物DNA甲基化的唯一形式。在植物基因组中存在三种类型的甲基化序列，分别为对称的CG序列、不对称的CHG和CHH序列。

DNA甲基化在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育以及疾病发生等诸多生物学过程中发挥着关键作用。在基因表达调控方面，当DNA甲基化发生在基因启动子区域的CpG岛时，通常会抑制基因转录，导致基因沉默。如在肿瘤发生过程中，某些肿瘤抑制基因启动子区域的高甲基化，使得这些基因无法正常表达，进而无法发挥抑制肿瘤的作用，最终导致肿瘤细胞的增殖和发展。在细胞分化过程中，DNA甲基化模式的动态变化帮助细胞获得特定的功能和表型。胚胎干细胞在分化为不同组织细胞的过程中，会伴随着特定基因的甲基化状态改变，从而调控细胞向不同方向分化。DNA甲基化对于维持基因组的稳定性也至关重要，它能够抑制转座子的活性，防止其在基因组中移动，避免因转座子插入导致的基因突变和基因组不稳定。

1.2DNA甲基化酶概述

DNA甲基化酶，也被称为DNA甲基转移酶，在DNA甲基化过程中起着核心催化作用。根据其功能和作用方式，主要可分为维持DNA甲基化转移酶（Dnmtl或维持甲基化酶）和从头甲基化酶。依据序列的同源性和功能进行细分，真核生物DNA甲基化转移酶又可分为4类，分别是Dnmtl/METl、Dnmt2、CMTs和Dn-mt3。其中，Dnmtl/METl类酶主要参与CG序列甲基化的维持，在DNA复制过程中，它能够识别亲代链上的甲基化胞嘧啶，并催化新合成链上相应位置的胞嘧啶发生甲基化，从而确保甲基化模式在细胞分裂过程中稳定传递给子代DNA。Dnmt3a和Dnmt3b则属于从头甲基化酶，它们在胚胎发育早期高度表达，主要负责在未甲基化的DNA区域建立新的甲基化位点，对胚胎早期细胞的甲基化状态设定起着关键作用，同时也参与重复序列的甲基化。Dnmt3L虽然没有催化活性，但它可以与Dnmt3a和Dnmt3b相互作用，增强它们的活性。

DNA甲基化酶的催化机制较为复杂，首先，酶会特异性地识别目标DNA序列中的CpG位点；随后，与DNA紧密结合形成酶-DNA复合物；接着，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，将甲基从SAM转移到胞嘧啶碱基上；最后，甲基化后的DNA从酶中释放出来，完成整个催化过程。在这一过程中，SAM的甲基基团在酶的作用下，准确地添加到DNA的胞嘧啶上，形成5-甲基胞嘧啶，从而实现DNA的甲基化修饰。

DNA甲基化酶在生物过程中具有不可或缺的重要性。在胚胎发育过程中，DNA甲基化酶建立和维持特定的甲基化模式，对细胞的分化和组织器官的形成起到关键的调控作用。在细胞增殖和分化过程中，DNA甲基化酶的活性变化会影响基因的表达模式，进而决定细胞的命运和功能。一旦DNA甲基化酶出现异常，将会导致DNA甲基化模式的紊乱，这与多种疾病的发生发展密切相关。在肿瘤发生过程中，DNA甲基化酶的异常表达可能导致肿瘤抑制基因的高甲基化和癌基因的低甲基化，从而促进肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和转移。某些研究表明，在乳腺癌、肺癌等多种癌症中，DNA甲基化酶的表达水平明显升高，且与肿瘤的恶性程度和预后密切相关。DNA甲基化酶的异常还与心血管疾病、神经系统疾病等多种疾病的发病机制存在关联。

1.3DNA甲基化酶的传统检测方法

传统上，用于检测DNA甲基化酶活性的方法有多种，包括高效液相色谱法（HPLC）、聚合酶链反应（PCR）、凝胶电泳、高效毛细管电泳（HPCE），以及使用同位素标记的S-腺苷甲硫氨酸甲基化检测等。高效液相色谱法利用不同物质在固定相和流动相之间的分配系数差异，对DNA甲基化酶催化反应后的产物进行分离和定量分析，从而确定酶的活性。聚合酶链反应则是通过扩增特定的DNA片段，结合对扩增产物的分析来间接检测DNA甲基化酶活性。凝胶电泳是根据DNA分子在电场中的迁移率差异，对DNA片段进行分离和检测