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质粒重组的留意事项

1质粒重组主要包括质粒提取、限制性酶切、目的片段回收、连接与连接

产物的转这五个基本步骤。现在结合本人在试验室长期从事质粒重组的

实际状况总结一下质粒重组试验操作的一些留意事项。

1.1质粒提取：质粒重组对质粒的质量要求比较高；我们试验室是用碱裂

解法提取质粒，一般说来，假如质粒的拷贝数比较高而小量制备的质粒量

可以满意试验须要的话，那么对于初学者本人不举荐在质粒提取这一步运

用大量制备方法，因为大量制备方法步骤过多对质粒的“损害”要大于小

量提取方法且所需时间相对较长。小量提取质粒过程中建议只用酚一氯仿

抽提一次即可，上清少取一些2（003一般）就不须要用氯仿再抽提一次

了，最终在用TER溶解质粒之前质粒的晾干最好是放在37度培育箱内，

若质粒提取起始菌液为1.5ml则晾干时间最好不要超过10分钟一（般5

分钟即可）；若质粒提取起始菌液为3ml则晾干时间最好不要超过20分

钟，质粒晾干后立刻加入TER于60度水浴锅中助溶20分钟。

1.2限制性酶切：一般我喜爱用总体积为8。3的酶切体系，加入的酶量

为lul（10个单位）。对于将来要做为载体的DNA模板一般切割量是2

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