牡蛎疱疹病毒模型注射感染闭壳肌舒张度注射量安全操作规范.docVIP

牡蛎疱疹病毒模型注射感染闭壳肌舒张度注射量安全操作规范

一、实验前准备

（一）实验材料与设备校准

牡蛎选择与预处理选取健康、规格统一的太平洋牡蛎（Crassostreagigas）作为实验对象，壳长范围控制在8-10cm，体重为150-200g。实验前需将牡蛎置于过滤海水中暂养7天，暂养环境参数严格控制：水温20±1℃，盐度30±1‰，pH值8.1±0.1，溶解氧含量≥6mg/L。暂养期间每日投喂小球藻（Chlorellavulgaris），投喂量为牡蛎体重的2%，并每日更换1/3的过滤海水，确保牡蛎状态稳定。实验前12小时停止投喂，避免消化活动对闭壳肌舒张度测量产生干扰。

病毒液制备与浓度标定牡蛎疱疹病毒（OsHV-1）毒株选用国际标准株OsHV-1μVar，由中国水产科学研究院黄海水产研究所提供。病毒液制备采用单层培养的牡蛎鳃细胞系（CGL）进行扩增，具体步骤如下：将冻存的毒株复苏后，按1:10的比例接种至长满80%的CGL细胞培养瓶中，置于25℃培养箱中培养72小时。待细胞出现80%以上病变效应（CPE）时，反复冻融细胞3次，4℃、12000rpm离心30分钟，收集上清液即为病毒原液。采用实时荧光定量PCR（qPCR）方法标定病毒浓度，以病毒拷贝数/μL为单位，将病毒原液稀释至1×10?、1×10?、1×10?拷贝数/μL三个梯度，分装后置于-80℃冰箱保存备用。

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