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罕见病筛查特异度性能确认办法

罕见病筛查特异度性能确认办法

一、（1）高通量测序技术平台的特异性验证体系构建。在罕见病筛查工作中，高通量测序技术的特异性表现是决定筛查结果可靠性的核心要素，其性能确认需建立多层级验证体系。首先需针对目标基因panel的设计特异性开展评估，通过生物信息学模拟分析探针与目标基因组区域的互补配对效率，计算脱靶率指标。选取覆盖已知罕见病致病基因的5000个外显子区域及相邻内含子序列，利用BLAST工具比对人类参考基因组（GRCh38.p13），统计非特异性结合位点的数量占比，要求脱靶率控制在0.5%以下。实际实验验证阶段，采用标准品DNA（如NA12878）进行建库测序，通过SAMtools软件分析比对结果，重点监测探针捕获区域与非目标区域的reads分布比例，当目标区域覆盖度达99.8%以上且非目标区域reads占比低于1%时，可判定panel设计符合特异性要求。其次需验证测序过程的碱基识别特异性，在不同测序平台（如IlluminaNovaSeq、MGISEQ-T7）上重复实验，统计碱基识别错误类型，特别关注G/T、A/C等易混淆碱基的误判率，要求单碱基特异性不低于99.99%。针对罕见病筛查中常见的低丰度变异检测需求，需构建包含0.1%-5%梯度突变频率的模拟样本，验证系统在低丰度条件下的特异性