第五章 霉菌及其毒素分析(多媒体）.doc

第五章 霉菌及其毒素分析 第一节 产毒霉菌及霉菌毒素的筛选 一、产毒霉菌的筛选 1、直接测定霉菌毒素。 2、动物试验 用于筛选产毒霉菌的动物主要有小白鼠和兔子。 ⑴ 小白鼠 常用于通过口服或注射毒性试验来筛选产毒青霉菌和曲霉菌等。方法是将分离纯化的霉菌接种于经过灭菌的饲料中，培养7～14天后，60℃干燥48h，以杀死或抑制霉菌生长，然后制成菌料，直接饲喂小白鼠，观察小白鼠的生长情况或死后变化。或用有机溶剂提取制成粗毒素，注射或投服，观察小白鼠的中毒情况或死后变化。 ⑵ 兔子 常用于皮肤局部刺激试验筛选镰刀菌或其它一些产生细胞毒素的霉菌。方法是将分离纯化的霉菌接种于经过灭菌的饲料或其它基质中，培养7～14天后，用有机溶剂提取制成粗毒素，将兔子背部毛剪净，涂搽粗毒素，观察兔子皮肤的毒性反应，如红肿、热痛、坏死等。 二、霉菌毒素的筛选和测定 霉菌毒素的发现通常有两种途径： ⑴ 在研究自然发生中毒过程中发现霉菌毒素，如黄曲霉毒素； ⑵ 在直接研究某种霉菌的产毒性能时发现毒素，如研究赭曲霉时发现赭曲霉毒素。 引起急性中毒的毒素易为人们发现和重视。但在多数情况下，引起慢性中毒如引起生产性能下降，对疾病的抵抗力降低等的霉菌毒素往往容易被人们忽视。所以，筛选及测定霉菌毒素对知道畜牧业生产、防病治病有重要的意义。 霉菌毒素的筛选和测定方法主要有： ㈠ 物理化学法 物理化学方法是利用气相色谱、高效液相色谱、薄层层析进行定量测定。这里主要就霉菌毒素的薄层层析分析作一介绍。 1、采样 由于霉菌毒素一般污染饲料的胚部，因而常规的随机抽样和分层定点采样方法有时不能代表成批饲料的真实情况。Cucullu等曾对2Kg花生样品进行逐粒观察，挑出其中20粒霉变花生，发现这些花生的黄曲霉毒素含量在0.3ppm至1100之间。即使样品中霉变花生比例变化很小，其结果也将发生很大的变化。所以，进行霉菌毒素分析时，其采集平均试样的采样点要比常规采样多。散装样品，需采100个点以上，袋装样品要采25%以上袋。平均试样经过粉碎后再缩分成试样，供测定用。 推荐的饿米军毒素的采样过程： 100个点以上 粉碎 匀浆 大批样品————3×3.5Kg（平均试样）——3×350g——3×2×100g。 25%袋以上 缩分 缩分 2、提取 霉菌毒素通常均为有机物，须用响应极性的有机溶剂提取。 常用有机溶剂： 粗提溶剂——甲醇、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙腈，这些溶剂单独使用或两种、两种以上配合使用。 纯化用溶剂（萃取）——石油醚，正己烷。 常用的提取方法：振荡提取30～45min； 高速匀浆提取3min。 3、纯化 霉菌毒素提取液的怀春化除了前述的萃取法、柱层析法和薄层色谱法外，还有液固提取法（Liquid-solid extractrion）和化学吸附法(Chemical absorption)。 液固提取法是利用多数霉菌毒素不溶于石油醚和正己烷的性质，用正己烷或石油醚除去试样中的脂肪、色素等弱极性杂质的一种纯化方法。此法常在试样提取前或与提取同时进行。 化学吸附法是吸附柱色谱的衍化，系用一些吸附剂如硅藻土、硅胶、活性炭、碳酸铜等将杂质吸附除去的一种方法，此法常与试样提取同时进行。 4、测定 下表所列的是几种霉菌毒素TLC进行测定的方法。 表5-1 几种霉菌毒素TLC分析方法 毒素名称 吸附剂 展开剂 Rf 显色方法 黄曲霉毒素B1 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮—正己烷（7﹕2﹕1） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.44 0.35 0.27 UV365nm 桔青霉素 硅胶+草酸 氯仿—甲醇（98﹕2） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.52 0.51 UV365nm 赭曲霉毒素A 硅胶 苯—乙酸（4﹕1） 0.40 UV365nm 展青霉素 硅胶 苯—甲醇（97﹕3） 苯—丙酮（9﹕1） 0.22 0.16 UV254nm 杂色曲霉毒素 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.67 0.27 UV254nm T-2毒素 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.45 0.22 硫酸铈 玉米赤霉烯酮 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮（9﹕1） 0.40 0.38 UV254nm 震颤素 硅胶 氯仿—甲醇（97﹕3） 氯仿—丙酮—正己烷（7﹕2﹕1） 0.40 0.51 UV254nm 硫酸铈加热 ㈡ 生物学试验 生物学试验方法主要包括细胞学试验、微生物学试验、免疫学试验和动物试验等。 1、细胞学实验 细胞学试验是利用某些霉菌毒素具有细胞毒性，对组织培养细胞具有毒性作用，引起细胞变形、细胞数减少