4食品中维生素B1的测定.pptVIP

实验四 食品中维生素B1的测定 一、实验目的 1. 了解食品中维生素B1测定的意义与原理； 2. 了解荧光分光光度计的使用方法及注意事项； 3. 掌握食品中维生素B1的测定方法； 二、基本原理 硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。 如样品中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液作测定。 三、实验器材 1. 仪器：荧光分光光度计；盐基交换管；Maizel－Gerson反应瓶 2. 试剂： （1）正丁醇：优级纯或重蒸馏的分析纯； （2）无水硫酸钠：分析纯； （3）淀粉酶； （4）去离子水或蒸馏水； （5）0.1mol/L盐酸：8.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL； （6）0.3mol/L盐酸：25.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL； （7） 2mol/L乙酸钠溶液：164g无水乙酸钠或272g含水乙酸钠溶于水中稀释至1000mL； （8）25%氯化钾溶液：250g氯化钾溶于水中稀释至1000mL； （9）25%酸性氯化钾溶液：8.5mL浓盐酸用25%氯化钾溶液稀释至1000mL； （10）15%氢氧化钠溶液：15g氢氧化钠溶于水中稀释至100mL； （11）1%铁氰化钾溶液：1g铁氰化钾溶于水中稀释至100mL，放于棕色瓶内保存； （12）碱性铁氰化钾溶液：取4mL?1%铁氰化钾溶液，用15%氢氧化钠溶液稀释至60mL。用时现配，避光使用； （13）3%乙酸溶液：30mL冰乙酸用水稀释至1000mL； （14）活性人造浮石：称取100g经40目筛的人造浮石，以10倍于其容积的3%热乙酸搅洗2次，每次10min；再用5倍于其容积的25%热氯化钾搅洗15min；然后再用3%热乙酸搅洗10min；最后用热蒸馏水洗至没有氯离子。于蒸馏水中保存； （15）硫胺素标准贮备液：准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素，溶于0.01mol/L盐酸中，并稀释至1000mL。此溶液每毫升相当0.1mg硫胺素。于冰箱中避光可保存数月； （16）硫胺素标准中间液：将硫胺素标准贮备液用0.01mol/L盐酸稀释10倍。此溶液每毫升相当10μg硫胺素。于冰箱中避光可保存数月； （17）硫胺素标准使用液：将硫胺素标准中间液用水稀释100倍，此溶液每毫升相当0.1μg硫胺素。用时现配； （18）0.04%澳甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入1.4mL?0.1mol/L氢氧化钠研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250mL。 四、操作步骤 1. 试样处理： 样品采集后用匀浆机打成匀浆(或者将样品尽量粉碎)于低温冰箱中冷冻保存，用时将其解冻后使用； 2. 提取： 精确称取一定量试样(估计其硫胺素含量约为10-30μg，一般称取5-20g试样)，置于150mL三角瓶中，加入50-75mL?0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其溶解，瓶口加盖小烧杯后放入高压锅中加热水解10.3×10?4Pa(151b/in2)30min，凉后取出。用2mol/L乙酸钠调其pH值为4.5(以0.04%溴甲酚绿为外指示剂)。按每克试样加入20mg淀粉酶的比例加入淀粉酶。于45-50℃温箱过夜保温(约16h)。冷至室温，定容至100mL，然后混匀过滤，即为提取液 3. 净化： 用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的三分之一高度。保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。用移液管加入提取液20-80mL(使通过活性人造浮石的硫胺素总量约为2-5μg)。加入约10mL热水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复三次。加入25%酸性氯化钾(温度为90℃左右)20mL，收集此液于25mL刻度试管内。冷至室温，用25%酸性氯化钾定容至25mL，即为试样净化液。重复5.3.1-5.3.4，将20mL硫胺素标准使用液加入盐基交换管以代替样品提取液，即得到标准净化液。 4. 氧化： 将5mL试样净化液分别加入A、B两个Maizel－Gerson反应瓶。在避光暗环境中将3mL?15%氢氧化钠加入反应瓶A，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将3mL碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶B，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将A、B两个反应瓶同时用力振摇，准确计时1.5min。重复5.4.1-5.4.2，用标准净化液代替试样净化液。用黑布遮盖A、B反应瓶，静置分层后弃去下层碱性溶液，加入2-3g无水硫酸钠使溶液脱水。 5. 荧光强度的测定 （1）荧光测定条件：激发波长365nm；发射波长435nm；激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。