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酵母双杂交系统 扬州大学生物科学与技术学院 酵母双杂交系统应用 鉴定新的蛋白与蛋白相互作用 鉴定蛋白级联底物 鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响 在已知的相互作用中鉴定干扰蛋白质 (反向双杂交系统) 酵母双杂交的原理 利用酵母作为真核蛋白相互作用的模型 利用诱饵质粒筛选文库或者单个已知蛋白 通过报告基因的转录鉴定蛋白的相互作用 使用不同的培养基筛选阳性克隆 酵母双杂交模型 文库筛选的步骤 将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒 将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母 再将文库质粒转化到酵母中 通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白 序列分析 从酵母中分离质粒然后转化E. coli 从大肠杆菌中提取质粒并测序 在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性 报告基因 LacZ reporter - Blue/White Screening HIS3 reporter - Screen on His+ media (usually need to add 3AT to increase selectivity) LEU2 reporter - Screen on Leu+ media ADE2 reporter - Screen on Ade+ media URA3 reporter - Screen on Ura+ media (can do negative selection by adding FOA) 质粒构建 在Gal4（或其他合适的蛋白功能域）的 DNA结合域前面的多克隆位点处插入待测基因序列构建诱饵质粒 诱饵质粒含有筛选基因，例如氨苄青霉素抗性基因，Leu2, Ura3, or Trp1等。 质粒样品 假阳性的问题 假阳性是酵母双杂交系统的最大问题 假阳性通常由以下原因造成: prey蛋白的非特异性结合 无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录（这是大多数假阳性的诱因） 假阳性的去除 通过序列分析去除 质粒消除实验剔除假阳性 重新转化含有诱饵质粒的酵母株或不含诱饵质粒的酵母株，分析两种情况后去除假阳性 利用一个不相关的蛋白作为诱饵蛋白测试相互作用 两不或多步筛选 酵母双杂交的优点 快速获得相互作用蛋白的基因 只需单一步骤的质粒构建 在体内鉴定蛋白的相互作用 弱小的，暂时的相互作用也能鉴定 能在整个时间段积聚弱小的相互作用信号 酵母双杂交应用举例 蛋白级联底物的鉴定 钙调蛋白与L-异天冬氨酰甲基转移酶的相互作用 E2F1 突变子的遗传特性 多肽荷尔蒙受体相互作用 Pha-4在线虫 C. elegans 中 的相互作用 参考文献 Bartel, Paul, C. Chien, R. Sternglanz, S. Fields. “Elimination of False Positives that Arise in Using the Two-Hybrid System.” Biotechniques (1993) Vol. 14, no. 6, p. 920-924. Chien, Cheng-ting, P. Bartel, R. Sternglanz, S. Fields. “The two-hybrid system: A method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) Vol. 88, p. 9578-9582. Fields, Stanley, O. Song. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature (1989) Vol. 340, p.245-246. James, Philip, J. Halladay, E. Craig. Genomic Libraries and a Host Strain Designed for Highly Efficient Two-Hybrid Selection in Yeast. Genetics (1996) Vol. 144, p. 1425-1436. Kamada, S, H. Kusano, H. Fujita, M. Ohtsu, R. Koya, N. Kuzumaki, Y. Tsujimoto. A cloning method for caspase substrates that uses the yeast two-hybrid system: Cloning of t