生物技术制药-03.pptVIP

第三讲 基因工程制药 喻昕 第三讲 基因工程制药 第一节 概述 第二节 基因药物生产的基本过程 第三节 目的基因的获得 第四节 基因表达 第五节 基因工程菌的稳定性 第六节 基因工程菌生长代谢的特点 第七节 基因工程菌发酵 第八节 基因工程药物的分离纯化 第九节 基因工程药物的质量控制 第十节 基因工程药物制造实例 第一节 概述 生物技术的核心就是基因工程，基因工程技术最成功的应用就是用于生物治疗的新型生物药物的研制。 传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。 基因工程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的优势。 应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。 如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得。 利用基因工程技术生产药品的优点： （1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障； （2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； （3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 利用基因工程技术生产药品的优点： （4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如白细胞介素-2的第125位半胱氨酸是游离的，有可能引起-S-S-键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高； （5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 基因工程技术可将不同种类和用途的基因，在原核细胞中表达的特性使其不仅在医药，而且在很多行业中都会有重要的应用。 第二节 基因工程药物生产的基本过程 基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 基因工程药物制造的主要程序是：目的基因的克隆，构建DNA重组体，将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌，工程菌的发酵，外源基因表达产物的分离纯化，产品的检验等。以上程序中的每个阶段都包含若干细致的步骤，这些程序和步骤将会随研究和生产条件的不同而改变。 基因工程药物制备的一般过程 基因工程药物生产的上游和下游 上游：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成； 下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。 工程菌（或细胞）构建中重要的工具 该过程中重要的工具便是酶：限制性内切酶和连接酶是将所需目的基因插入适当的载体质粒或噬菌体中并转入大肠杆菌或其他宿主菌（细胞）大量复制目的基因过程中的重要工具。 同时为保证目的基因的正确性，对目的基因要进行限制性内切酶和核苷酸序列分析。 基因表达系统就是上述的工程菌或细胞，有原核生物和真核生物两类表达系统；选择基因表达的系统主要考虑的是保证表达蛋白质的功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。 下游阶段在产业化中是极其重要的 下游阶段是将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。 工程菌的发酵工艺不同于传统的抗生素和氨基酸发酵，需要对影响目的基因表达的因素进行分析，对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因高效表达的发酵工艺，同时建立一系列相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术。 第三节 目的基因的获得 对于目的基因的获得需要根据目的基因的来源采取适当的方法。 对于真核细胞来源的目的基因，是不能直接进行分离的。真核细胞中单拷贝基因仅是染色体DNA中的很小一部分，即使多拷贝基因也是极少的，因此从染色体中分离纯化目的基因是很困难的。 另外，原核表达系统是有局限性的，主要是由于真核基因的内含子及基因的后翻译过程，所以真核系统得到了相应发展。 第三节 目的基因的获得 目前克隆真核基因常用的方法有逆转录法和化学合成法 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶I（或者Kle