【医学遗传学实验指导】基因检测相关的实验.docVIP

第四章　基因检测相关的实验 人类基因组计划的完成以及后基因组学研究的不断深入，标志着现代医学的发展已逐步进入“基因组医学”的时代。分子医学诊断技术运用，将二十一世纪人类医疗保健福音。 掌握人外周血基因组DNA的抽提方法。 二、实验原理 从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的DNA是进行基因诊断的先决条件。制备高质量DNA的原则是：①将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净；②尽可能保持DNA分子的完整。 在提取DNA的反应体系中，蛋白酶K为广谱蛋白酶，其主要特征是能在SDS和EDTA存在的情况下保持很高的活性，可将蛋白质降解成小的多肽和氨基酸。SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：①破坏细胞膜及核膜；②解聚细胞中的核蛋白；③与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来；④抑制DNA酶活性，使DNA分子尽量完整地分离出来。 三、实验用品和材料 （一）试剂 1．抗凝剂：EDTA 2%（W／V）生理盐水抗凝剂。称取2g EDTANa2、0．85g NaC1，加双蒸水至100m1。1ml该试剂可抗10ml全血凝结；亦可用医用人ACD抗凝剂抗凝。肝素能抑制限制性内切酶活性，因此一般不用肝素抗凝。 2．15mmo1／L Tris-HCl（pH8.0），15 mmo1／L EDTA（pH8.0），15 mmo1／L NaCl （简称TES溶液）；用lmo1／L Tris-HCl（pH8.0），0.5 mmo1／L EDTA（pH8.0），3mo1／L NaCl稀释成15 mmo1／L TES溶液。 3．10%（W／V）SDS。 4．15mmo1／L TES饱和酚，重蒸酚在热水浴（100℃）中溶化后加入1/3体积的15 mmo1／L TES溶液，充分混匀后，放冰箱中静置6h以上。酚层在下，水层在上。吸掉上层多余的TES溶液，冰箱中避光保存备用。为防止酚被氧化成酮，可加少量8-羟基喹啉（2 mmo1／L～5mmo1／L）。 5．氯仿／异戊醇（24：1，V/V），现配现用。 6．蛋白酶K。 7．10mmo1／L Tris-HCl，1mmo1／L EDTA（pH7.5）（简称TE溶液）。用1mo1／L Tris-HCl（pH7．5），0．5mo1／L EDTA（pH 7．5～8．0）稀释配制。 （二）用品：Eppendorf试管、离心管、吸管、加样器、枪头、离心机、水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽。 四、实验方法和步骤 1．白细胞的分离 （1）抗凝血用1～2倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水（PBS）稀释并混合。 （2）在50ml离心管中加入1倍体积淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），在上面仔细铺一层2倍体积已稀释的血液。 （3）室温以2000rpm离心15min～20min，红细胞应沉于管底，而白色的淋巴细胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。 （4）吸弃血浆，小心吸取淋巴细胞层，直至把淋巴细胞转移完全。 （5）用生理盐水或PBS洗淋巴细胞二次。 （6）最后得到的淋巴细胞沉淀，可立即用于DNA的提取，或冻存于超低温冰箱中，直至使用。 2．DNA的提取 （1）在5 m1 15mo1／L TES中悬浮白细胞，加蛋白酶K 250μg～350μg（50μg/ m1～70μg/ m1），10%SDS至终浓度0.5%（加260μl左右）。 （2）充分混匀，放50℃水浴中保温3h～5h，其间振摇2～3次。 （3）冷却至4℃，加等体积15 mo1／L TES饱和酚。 （4）轻轻振摇，使水相和酚层充分混匀。 （5）4℃5000rpm～8000rpm离心15min～20min。此时DNA溶液在上层，酚位于下层，中间是变性蛋白层。 （6）用吸管小心吸取上层粘稠溶液，移至另一离心管。注意尽量不要带出中间蛋白层。 （7）DNA溶液再加等体积15 mo1／L TES饱和酚抽提一次，按（5）、（6）离心并吸至另一离心管。 （8）加等体积氯仿/异戊醇按步骤（4、5）抽提，离心5min。 （9）吸出DNA溶液后，再步骤（8）抽提一次。 （10）用吸管将DNA溶液移至Eppendorf中，冰浴至0℃。 （11）加2.5倍体积95%冷乙醇震摇，可见DNA白色沉淀析出。 （12）用75%冷乙醇清洗3～4次。 （13）室温干燥或冷冻干燥DNA。 （14）加适量TE溶液溶解DNA。 3．DNA的鉴定及定量 （1）比色法：取DNA溶液20μl，用蒸馏水稀释至400μl。以蒸馏水做空白，在紫外分光光度计上测定OD260、OD280、OD230三个数值。 对于纯DNA，1个OD260=50μg/mlDNA，因此DNA含量应为50μg/ml ×OD260×稀释倍数。 按上