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引物设计 引物设计的原则 引物的特异性 引物的长度 G+C含量与Tm值 ?G值 碱基随机分布 引物的3’端 引物自身 引物之间 引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过连续8个互补碱基同源。 引物的长度 寡核苷酸引物长度为15～30bp，一般为18～24bp。引物的长度不能大于38，因为引物长度过长时，导致延伸温度会超过74℃, 不适合Taq DNA聚合酶的最适温度,不能保证产物的特异性；但长度也不应该小于15，小于15时易产生错配。 G+C含量 G+C含量一般为40%～60%，最好在45%～55%之间。 G+C含量过高或过低都不利于引发退火反应。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。两引物之间Tm值相差不应超过3度。粗略估计Tm值的公式：Tm= 4（G+C）+2（A+T）。退火温度=Tm-5℃ ?G值 ?G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端?G 值较低，而5’端和中间?G 值相对较高的引物。引物的3’端的?G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。 碱基随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 引物的3’端 引物的延伸是从