紫外可见光分光光度计酶活性测定的实验流程和方法.pdfVIP

文献参考 使用酿酒酵母己糖激酶和葡萄糖-6- 磷酸脱氢酶 在Eppendorf BioSpectrometer® kinetic 紫外/ 可见光 分光光度计上进行酶动力学测定 简介 该用户指南将演示使用Eppendorf BioSpectrometer 紫外/可见光分光光度计进行的酶活性测定。为优化测定流程，先使用“单 波长λ- 连续” （Single λ- continuous ）测定法进行初步测定。然后，根据这些结果进行实际活性测定。通过线性回归确定酶活性。 为了进行测定，使用源自面包酵母的己糖激酶和葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶进行偶联反应。由于 Eppendorf BioSpectrometer kinetic 紫外/可见光分光光度计（动力学款）带有温控比色皿槽，也可演示这一反应对温度的依赖性。在37 °C 时，检测到最高活性。 引言 己糖激酶反应的代谢意义 糖酵解 几乎所有生物新陈代谢的一个中间环节就是葡萄糖分别在细 由于NADP （NAD）和NADPH2 （NADH2 ）分别参与中间代 胞的细胞液或细胞质内进行的酶促降解。这一过程叫做糖酵 谢中几乎所有酶促反应，酶活性的确定主要是通过NADPH2 解。葡萄糖通过分步反应转化为2 分子的丙酮酸。1 分子的 的增加或减少来确定。NADP 和 NADPH2 均在 260 nm 波 葡萄糖生成2 分子的ATP 和2 分子以NADPH2 形式存在的 长下显示出最大吸收峰。然而，NADPH2 在340 nm 波长下 氧化还原产物。然后，丙酮酸进入初步代谢途径，即丙酮酸 还会显示一个波峰 （图 1），这就可以在光度测定上区分 循环，进一步生成呼吸链的还原产物，最终转化为氧。最终 NADPH2 和NADP。 的降解产物是H O 和CO 。 2 2 NAD(P)/NAD(P)H 光谱 2 己糖激酶反应活化葡萄糖 3.000 葡萄糖的降解维持着所有生物的呼吸作用。在降解葡萄糖之 2.500 NAD(P) 前，需使葡萄糖易于降解，即激活。这一过程包括己糖激酶 2.000 NAD(P)H2 催化的葡萄糖磷酸化和消耗ATP ，生成葡萄糖-6- 磷酸。后 度 光 1.500 者实际上是糖酵解的初始底物 （图1）。 吸 1.000 另外，葡萄糖 -6- 磷酸也是进一步重要代谢途径 ，即戊糖 0.500 磷酸途径的初始底物。戊糖磷酸途径可提供重要的氧化还原 0.000 产物，如NADPH2 ，以及被认为进一步参与分解代谢和