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全内反射荧光显微镜（Total Internal Reflection Fluorescence Microscope ,TIRFM） 06医实 王冰凝发展历史 全内反射荧光显微镜的概念 传统光学显微镜的缺点 全内反射荧光显微镜的优势 TIRFM的发展历程 全内反射荧光显微镜的概念 全内反射荧光显微镜：利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200 nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。 传统光学显微镜在生物样本显微方面的缺点 信噪比不高，分辨率不高，同时光学显微镜有空间分辨极限，约为250 nm。从生物学应用的角度，传统的光学显微镜显然无法满足更高的空间分辨率要求，并且研究过程中需要破碎细胞或对细胞造成损伤，无法做到在活细胞生理条件下实时地对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究。 全内反射荧光显微镜的优点 信噪比高，分辨率高，对生物样本损伤小，装置简单，容易和其它成像技术、探测技术相结合，空间分辨率也已经可以小于100nm。凭借它独特的优势成为当今世界上研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的生物光学显微技术。 TIRFM的发展历程 1965年，Hirschfeld完成了第一个全内反射荧光实验，他成功的使用隐失波（evanescent wave）激发来进行单分子探测。他用80-100个荧光分子来标记蛋白质分子，从而在单个荧光团量级上，实现了对荧光标记的蛋白分子运动的观察。这种将全反射理论与生物细胞的荧光成像技术相结合在当时是一种全新的突破。 TIRFM的发展历程 上世纪80年代初，Axelrod和Daniel等生物物理学家对TRIFM技术及基本原理进行描述，他们利用TIRFM对荧光脂质标记的人类皮肤成纤维细胞的细胞-基膜连接进行了研究，另外几乎是在同一时间，科学家也通过TIRFM和FRAP(荧光漂白恢复技术)的结合使用对生物分子表面的动力学进行了研究。 TIRFM的发展历程 上世纪90年代初，随着新型物镜透镜、聚光镜和超灵敏探测器的出现，使TRIFM技术得到充分发展。 TIRFM的发展历程 1995年，Yanagida等人第一次用TIRFM技术，将单位时间（秒）单位区域（以一个衍射极限面积为单位，微米级别）内的背景信号降低到3个光子，在液体溶液中得到了荧光标记的单个肌动球蛋白质分子的成像，并且探测到了单个ATP酶的翻转反应。从此TIRFM开始广泛应用于单分子的成像研究。 TIRFM的发展历程 1996年，Moerner等人用TIRFM技术实现了被限制在丙烯酰胺胶体的纳米小孔中的单分子的三维成像。 TIRFM的发展历程 1997年，Pierce等人用TIRFM技术成功追踪到绿色荧光蛋白（GFP）运动分子沿着微管的实时运动，这个发现使得TIRFM技术迅速广泛的应用于膜表面动力学和膜表面生物化学运动的研究。 TIRFM的发展历程 21世纪以来，全内反射荧光法的方法多种多样，包括时间分辨全内反射荧光、多重内反射荧光和全内反射荧光相关光谱等方法。它研究的内容也很广泛，包括观察表面分子或近表面分子的取向、旋转和荧光寿命，肌球蛋白酶活性测量，单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移，基因芯片荧光检测等等。 全内反射荧光显微镜系统 现今已发展多种TIRFM系统 最普遍的两种类型：棱镜型，物镜型 棱镜型TIRFM系统 棱镜型全内反射显微镜系统包括三个主要的部分：倒置的相衬光学显微镜，可以二维精确移动的样品台，用来发生全反射的棱镜。 从激光器出来的光以精确选定的入射角入射到棱镜上，在载玻片的表面发生全反射（棱镜与玻片之间配以折射率匹配的浸没油）。产生的隐失波激发位于两玻片之间的样品，发射出荧光。荧光信号由一个高数值孔径的物镜收集，经过相应的成像放大系统，最后被探测器（如CCD）接收。（如图a） 物镜型TIRFM系统 在物镜型全内反射显微术中，显微镜的物镜即作为收集样品荧光信号的接收器，同时又作为发生全内反射的光学器件。激光聚焦到物镜后焦面并经过物镜边缘入射，物镜出射光为平行光并斜入射至盖玻片上，调节激光入射位置和角度，即可达到全内反射要求，从而实现隐逝波照明。（如图b） 两种TIRFM系统之比较 棱镜型系统在实现上更加容易，它只需要激光光源、棱镜和显微镜。在探测上，它也不容易受到入射光信号的干扰。但它放置样品的空间受到棱镜的限制，而且出射到斜上方的激光光束对实验人员的构成一定的辐射威胁。 物镜型系统中发生全内反射时，激光光束被约束在物镜内部，对实验人员的辐射威胁小。样品的放置非常方便，对样品的控制可与其它技术相