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实验三 巴斯德效应 一、目的要求 学习和掌握巴斯德效应的原理及测量方法。 二、 基本原理 二、 基本原理 巴斯德效应：氧对发酵的抑制作用。酵母菌在无氧发酵中将葡萄糖分解成乙醇和CO2 。通进氧气，乙醇停止产生，葡萄糖消耗率明显下降。一般兼性厌氧微生物都具有明显的巴斯德效应。 测定项目： 细胞干重、发酵液中还原糖的量（3，5－二硝基水杨酸比色定糖法） 3，5－二硝基水杨酸比色定糖法原理： 3，5－二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系，可用于比色测定，通过与还原糖的标准曲线比较，可得出溶液中的还原糖量。此法操作简便、快速、杂质干扰少。 三、实验器材 菌种：啤酒酵母 (S.crovisiae) 培养基： 蛋白胨10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，NaCl 0.5g，水 1000ml，pH7.2 器具： 厌氧培养装置（干燥器）、三角瓶、30ml试管、酒精灯、接种环等 。 四、操作步骤 菌悬液制备: 将生长旺盛的酵母菌菌苔从斜面上用生理盐水洗下，制成细胞悬液。 液体培养基分装：分好养与厌氧两种。 取液体培养基50ml装于250ml三角瓶中，瓶口塞以纱布塞，灭菌后作好氧培养。 取液体30ml装入大试管，瓶口塞以橡胶塞，灭菌后作厌氧培养用。 接种培养：分好养与厌氧两种 好氧培养：取菌悬液各1ml，分别接种于两个装有50 ml培养液的500ml三角瓶中。28oC摇床培养,培养时间24 _ 48小时，摇床转速200转/分。设接无菌水对照。 厌氧培养：化学吸氧法＋干燥器培养。 各取1ml的两种悬液，分别接种装有30 ml培养液的大试管。预先在干燥器内装焦性没食子酸和NaOH，将接种的试管放入干燥器内，在器皿上涂上凡士林，使之密封，然后抽气10至15分钟关闭活塞。晃动干燥器，使NaOH倾倒与焦性没食子酸混合，产生吸氧作用。 每克焦性没食子酸在过量碱液中能吸收100ml空气中的氧，常用1克焦性没食子酸加10%的NaOH 10ml配制。 取样测定： 菌体干重：分别取发酵液10ml于已称好干重的离心管中，5000－6000转/分，离心5分钟，取上清液于另一离心管中，带菌体的离心管放入105 _110oC烘箱中，烘干1小时，冷却后称重，然后求出每ml菌液中菌体干重。 发酵液中还原糖含量：同时取培养液的上清液（去除菌体）及对照培养基，按下表加入试剂： 五、结果与讨论 由0～5号管的数据，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，A540为纵坐标，绘制标准曲线；从标准曲线中求样品管中葡萄糖的含量(mg)。 求出每生长1mg菌体（干重），需要消耗多少mg糖（即糖的利用率）？ 比较酵母培养在通气与缺氧条件下的生长量及糖利用率，它们之间是否有差别，这说明什么？ * * ? 记录吸光度（A540） 以0号管为空白参比，测定l=540nm处的吸光度 比色 冷却；分别用蒸馏水定容至25mL 定容 各管混匀，沸水浴5分钟 反应 各2.0 DNS试剂(mL) ?1.0 1.0 1.0 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 蒸馏水(mL) ?1.0 1.0 1.0 样品待测液(mL) ? 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 葡萄糖标准液(mL) 对照? 厌氧发酵液 好氧发酵液 5 4 3 2 1 0 样品 标准葡萄糖浓度梯度 空白 管号 操作