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酶联免疫吸附试验及其应用 作者：鲍行豪 一、 前 言 近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以 后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继 50 年代的免疫荧光（IFA） 和 60 年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在 70 年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分 析技术。由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生 反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种 技术被称为酶联免疫吸附试验法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA），本法自 70 年代初期由 VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及 PERLMARN 等相继分别报道后，现已引起广泛重视。 ELISA 法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、 寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据 已经使用的结果，认为 ELISA 法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。 不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于 血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也 是一种早期诊断的良好方法。因此 ELISA 法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个 方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。 二、方法的基本原理和种类 ELISA 的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水 性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学 和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反 应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可 以按底物显色的程度显示试验结果。 由于ELISA 法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。而另一 方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化底物分子发生反 应，产生放大作用，正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，ELISA 法是一种既 敏感又特异的方法。常用的 ELISA 有以下两个方面。 (一)测定抗原的，主要有四种方法。 1、竞争法（Competition method）:方法的基本原理可见图 1：本法首先将特异性抗体吸附 于固相载体表面，我们把抗原和抗体吸附到固相载体表面的这个过程，称为包被 （Coated），也 可叫做致敏。经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，而另一组只加酶标记 抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为我们所要测定的未知抗原的量。 这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的 测定常用此法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程。但需用较多量的酶标记抗原为其 缺点。 图 1：竟争法测抗原示意图 2、双抗体夹心法 方法的基本原理可用图 2 来表示