汽酒 大肠菌群的测定 乳糖发酵法.pdfVIP

FSPJLQJ005 汽酒 大肠菌群的测定 乳糖发酵法 F_SP_JL_QJ_005 汽酒—大肠菌群的测定—乳糖发酵法 1 范围 本方法采用乳糖发酵法测定汽酒中大肠菌群的MPN 值。 本方法适用于汽酒中大肠菌群的测定，以MPN/100mL 报告其结果。 2 原理 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有 否污染肠道致病菌的可能。 3 试剂 3.1 溴甲酚紫溶液，0.4g/L 3.2 乳糖胆盐发酵管：将蛋白胨20g 、猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g 及乳糖10g 溶于1000 mL 水中，校正PH 至7.4 ，加入溴甲酚紫溶液25mL ，混匀后分装每管10mL ，并放入一个小倒管， 115℃高压灭菌15min 。。 3.3 双料乳糖胆盐发酵管：将蛋白胨40g 、猪胆盐 （或牛、羊胆盐）10g 及乳糖20g 溶于1000 mL 水中，校正PH 至7.4 ，加入溴甲酚紫溶液50mL ，混匀后分装每管10mL ，并放入一个小 倒管，115℃高压灭菌15min 3.4 乳糖发酵管：将蛋白胨20g 及乳糖 10g 溶于 1000 mL 水中，校正PH 至7.4 ，加入溴甲 酚紫溶液25mL ，混匀后按检验要求分装30 mL 、10mL、3 mL，并放入一个小倒管，115℃ 高压灭菌15min 。 3.5 EC 肉汤：将胰蛋白胨20g 、3 号胆盐 （或混合胆盐）1.5g、乳糖5g、磷酸氢二钾4g 、磷 酸二氢钾1.5g 及氯化钠5g 混合，溶于1000 mL 水中，溶解后分装有发酵倒管的试管中，并 放入一个小倒管，121℃高压灭菌15min ，最终PH 为6.9 ±0.2 。 3.6 伊红美蓝琼脂平板：将蛋白胨 10g、磷酸氢二钾2g 及琼脂17g 溶解于蒸馏水中, 校正PH 至7.1 分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min ，临用时加入乳糖10g 并加热溶化琼脂，冷至50～ 55℃，加入伊红美蓝溶液（6.5g/L ）10 mL ，摇匀，倾注平板。 3.7 革兰氏染色液： 3.7.1 结晶紫染色液：将1g 结晶紫溶解于20 mL 乙醇（950g/L ）中，然后与80 mL 草酸铵溶 液（10 g/L）混合均匀。 3.7.2 革兰氏碘液：将 1g 碘与2g 碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶 解后，再加蒸馏水至300mL 。 3.7.3 沙黄复染液：将0.25g 沙黄溶解于10 mL 乙醇（950g/L ）中，然后用蒸馏水稀释至100mL 。 4 仪器 4.1 温箱：36 ±1℃ 4.2 恒温水浴：44.5 ±0.5℃ 4.3 显微镜 5 操作步骤 5.1 样品处理：用点燃的酒精棉球烧灼瓶口灭菌，用石碳酸纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖 启开，含有二氧化碳的酒类可倒入另一灭菌容器内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡， 待气体全部逸出后，进行检验。 5.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量分别为 10mL 、1mL、0.1 mL ，接种量在 lmL 以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lmI ，及lmL 以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀 1 释度接种3 管，置36 士l ℃温箱内，培养24 士2h ，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可 报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。 5.3 分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36 士1℃温箱内，培养18 一24h ， 然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。 5.4 革兰氏染色试验 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min ，水洗，然后滴加革兰氏碘液，作用 1min ，水洗，再滴加乙醇（950g/L ）脱色约30s，（或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用 乙醇滴满整个涂片，脱色 10s）水洗，最后滴加沙黄复染液复染1min 。水洗，待干，镜检。 革兰氏阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色。 5.5 证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落 1~2 个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管， 置36 士1℃温箱内培养24 士2h ，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染